李宏博 朱 琳 趙 松 劉淑霞 趙 雪 郝 軍＊

（1河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，石家莊050017；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院肌電圖室，石家莊050051）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也被稱作非折疊蛋白反應(yīng) （unfolded protein response，UPR），已被證實(shí)參與了糖尿病腎病的發(fā)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及了多種調(diào)控因子和通路［1］。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶1／X 盒子結(jié)合蛋白－1（inositol requiring 1／X－box binding protein1，IRE1／XBP－1）是經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，該通路被激活，進(jìn)一步避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生［2］。XBP－1有兩種狀態(tài)：非拼接型和拼接型，其中拼接型XBP－1比非拼接型XBP－1有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，通過影響基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)相關(guān)的生理活性［3］。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)XBP－1除了參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激外，還具有調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的功能。在XBP－1敲除小鼠，影響肝臟脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致血清甘油三酯和膽固醇降低［4］。Nishina等人發(fā)現(xiàn)高表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，喂食過量含鐵食物，導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白－1（sterol regulatory element binding protein－1，SREBP－1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）、拼接型和非拼接型 XBP－1、磷酸化真核生物翻譯起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor－2alpha， p－eIF2α），CCAAT／增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT／enhancer－binding protein homology protein，CHOP）高表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)大量自噬體。然而，抗氧化劑N乙酰半胱氨酸（N－acetyl cysteine，NAC）顯著降低了轉(zhuǎn)基因小鼠的拼接型和非拼接型 XBP－1、peIF2α、CHOP和肝脂肪變性［5］。腎臟脂質(zhì)代謝異常被揭示參與了多種腎臟疾病，例如糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、原發(fā)性腎小球腎炎等。XBP－1是否是導(dǎo)致腎臟細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)沉積的機(jī)制之一還未見報(bào)道。

因此，本研究使用人腎近端小管上皮細(xì)胞（human renal proximal tubular cell line，HKC），轉(zhuǎn)染拼接型和非拼接型XBP－1質(zhì)粒，48h后檢測脂質(zhì)代謝因子脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl－CoA carboxylase，ACC）和脂肪分化相關(guān)蛋白（adipose differentiation related protein，ADRP），以明確高表達(dá)的XBP－1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。

材料和方法

1．試劑

油紅O購自美國Sigma公司，脂質(zhì)體2000、Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，兔抗XBP－1抗體購自Abcam公司，兔抗β－actin抗體購自Epitomics公司，PCR擴(kuò)增試劑購自Promega公司。拼接 型 XBP－1 質(zhì) 粒 （spliced XBP－1plasmid，XBP－1splasmid）和非拼接型XBP－1質(zhì)粒（unspliced XBP－1plasmid，XBP－1μplasmid）由日本京都大學(xué)生物物理研究室的Kazutoshi Mori教授惠贈(zèng)。

2．細(xì)胞

人腎小管上皮細(xì)胞株由301醫(yī)院陳香美教授惠贈(zèng)，細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞隨機(jī)分為三組：未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（pcDNA3．1）、拼接型 XBP－1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（XBP－1s plasmid）和未拼接型 XBP－1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（XBP－1μ plasmid）。

3．方法

3．1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體2000，HKC細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至約90%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。4．0μg載體DNA和10μl脂質(zhì)體2000分別溶解于250μl無血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，混合，室溫放置20min后加入6孔板內(nèi)。5h后更換全血培養(yǎng)基，48h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

3．2免疫印跡

從HKC細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)10%SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，含5%BSA的TTBS 37℃孵育1h，一抗4℃孵育過夜，XBP－1（1∶500）、β－actin（1∶1000）。PVDF膜用TTBS清洗3次，每次10min，二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TTBS洗膜3次后，加ECL發(fā)光液孵育1min，紅外線凝膠成像儀檢測，圖像分析采用IPP5．0，以目的基因與β－actin條帶的IOD比值作為最終結(jié)果。

3．3逆轉(zhuǎn)錄PCR

細(xì)胞用PBS洗滌2次，盡量將液體吸干，加入Trizol 1ml裂解細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，選擇波長260nm測RNA總濃度，A260／A280在1．8－2．0之間。在逆轉(zhuǎn)錄酶（MLV）催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物均由Invitrogen公司合成（見Tab．1）。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃5min，進(jìn)入循環(huán)，94℃50s，55℃50s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)后72℃8min。將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)，用LabWorks 4．5軟件進(jìn)行積分光密度值（integrated optical density，IOD）測定，以管家基因GAPDH作為內(nèi)參照校正，用目的基因的積分光密度值與GAPDH積分光密度值的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

表1 FASN，ACC和GAPDH引物和擴(kuò)增片段Table 1 Primers and product for FASN，ACC and GAPDH

3．4免疫細(xì)胞化學(xué)

HKC細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片，終止培養(yǎng)后，10%中性福爾馬林固定15min，0．3% 曲拉通X－100 37℃孵育20min，山羊血清37℃封閉30min，抗ADRP一抗（1∶100）4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5min，生物素化的二抗37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min，DAB顯色。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

3．5油紅O染色

HKC細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片上，終止培養(yǎng)后，10%中性福爾馬林固定15min，油紅O染液染色15 min，玻片70%酒精中浸泡5s以去除背景著色。蘇木素復(fù)染，自來水沖洗干凈，晾干后甘油明膠封片。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Student－Newman－Keuls法，P＜0．05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．拼接型和非拼接型XBP－1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞上調(diào)XBP－1表達(dá)

拼接型XBP－1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞48h后，拼接型XBP－1（分子量為54kDa）明顯升高，分別為空白對(duì)照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的3．73倍和3．72倍，但對(duì)非拼接型XBP－1（分子量為33kDa）的表達(dá)未產(chǎn)生明顯影響。相似地，非拼接型XBP－1質(zhì)粒上調(diào)了HKC細(xì)胞非拼接型XBP－1蛋白的表達(dá)，對(duì)拼接型XBP－1未見影響（Fig．1）。

圖1 拼接型和非拼接型XBP－1質(zhì)粒上調(diào)HKC細(xì)胞XBP－1蛋白表達(dá)Fig．1The spliced XBP－1plasmid and unspliced XBP－1 plasmid elevated XBP－1protein in HKC cells

2．拼接型 XBP－1質(zhì)粒上調(diào) HKC細(xì)胞內(nèi)FASN、ACC mRNA表達(dá)

FASN和ACC是脂肪酸代謝中的關(guān)鍵酶，轉(zhuǎn)染拼接型XBP－1質(zhì)粒的 HKC細(xì)胞FASN和ACC mRNA均明顯升高，分別是空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的2．07倍和1．82倍；然而，非拼接型XBP－1質(zhì)粒對(duì) HKC細(xì)胞FASN和ACC mRNA的表達(dá)未產(chǎn)生明顯影響（Fig．2）。

圖2 拼接型XBP－1質(zhì)粒升高了HKC細(xì)胞FASN和ACC mRNA的表達(dá)Fig．2The spliced XBP－1plasmid increased FASN and ACC mRNA in HKC cells

3．拼接型XBP－1質(zhì)粒升高了HKC細(xì)胞ADRP表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)脂滴

ADRP是細(xì)胞內(nèi)脂滴的標(biāo)記蛋白，相比于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和非拼接型XBP－1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，拼接型XBP－1質(zhì)粒顯著升高了HKC細(xì)胞內(nèi)ADRP蛋白的表達(dá)（Fig．3）。油紅O染色被用來檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，結(jié)果揭示拼接型XBP－1質(zhì)?？擅黠@升高HKC細(xì)胞內(nèi)脂滴（Fig．4）。

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HKC細(xì)胞ADRP表達(dá) （×400）A：正常對(duì)照組；B：空白質(zhì)粒組；C：拼接型XBP－1質(zhì)粒組；D：非拼接型XBP－1質(zhì)粒組Fig．3ADRP expression in HKC cells of immunocytochemistry（×400）A：normal control group；B：blank plasmid group；C：spliced XBP－1plasmid group；D：unspliced XBP－1plasmid group

圖4 油紅O染色檢測HKC細(xì)胞內(nèi)脂滴 （×400）A：正常對(duì)照組；B：空白質(zhì)粒組；C：拼接型XBP－1質(zhì)粒組；D：非拼接型XBP－1質(zhì)粒組箭頭示細(xì)胞內(nèi)脂滴Fig．4Lipid droplet formation of HKC cells by Oil Red O staining（×400）A：normal control group；B：blank plasmid group；C：spliced XBP－1plasmid group；D：unspliced XBP－1plasmid group arrows show cellular lipid droplets

討 論

X－盒子是位于人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）DR alpha啟動(dòng)子區(qū)的保守轉(zhuǎn)錄元件，X－盒子結(jié)合蛋白1是一種結(jié)合于X－盒子的轉(zhuǎn)錄因子［6］。由非拼接型XBP1（μ）mRNA翻譯而來，分子量為33kDa，XBP1（μ）蛋白具有DNA結(jié)合區(qū)域，但沒有活性區(qū)域。XBP1（μ）mRNA 經(jīng)IRE1拼接后，閱讀框發(fā)生移位，翻譯后形成54kDa大小的蛋白，即拼接型 XBP－1（s）蛋白，含有DNA結(jié)合區(qū)和活性區(qū)［7］。

有研究揭示XBP－1有多種功能，如漿細(xì)胞分化［8］，病毒復(fù)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［9］，最近有報(bào)道證實(shí)XBP－1有新的功能，可通過影響肝臟的脂質(zhì)代謝降低血清甘油三酯和膽固醇的含量［4］。隨后陸續(xù)有研究也揭示了XBP－1對(duì)脂質(zhì)代謝的影響。So JS等人發(fā)現(xiàn)XBP－1缺乏反饋性激活上游的IRE1α，進(jìn)而啟動(dòng)調(diào)節(jié)性IRE－1依賴性降解過程（regulated IRE－1－dependent decay，RIDD），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) mRNAs的降解，參與調(diào)控細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。抑制調(diào)節(jié)性IRE－1依賴性降解過程或IRE1α可逆轉(zhuǎn)XBP－1基因敲除小鼠的低脂血癥。而在高血脂的動(dòng)物模型，抑制XBP－1可有效改善肝臟脂肪變性、肝臟損傷和高膽固醇血癥［10］。Gregor MF等人在哺乳期的小鼠發(fā)現(xiàn)，敲除脂肪細(xì)胞的XBP－1減少了奶的產(chǎn)量，幼鼠生長緩慢，提示脂肪細(xì)胞XBP－1對(duì)哺乳期的脂質(zhì)代謝有重要影響［11］。

腎臟脂質(zhì)沉積見于多種疾病，如糖尿病腎病，腎小球腎炎，狼瘡性腎炎，是引起腎臟硬化和功能不全的重要因素之一［12］。ADRP首先由Ginette等人克?。?3］，是一種脂滴標(biāo)記蛋白。目前，XBP－1蛋白是否對(duì)腎臟固有細(xì)胞ADRP表達(dá)和脂質(zhì)代謝有影響還未見研究。本研究針對(duì)腎小管上皮細(xì)胞，研究了XBP－1蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果揭示非拼接型XBP－1質(zhì)粒和拼接型XBP－1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞后，分別升高了非拼接型XBP－1蛋白和拼接型XBP－1蛋白表達(dá)。然而，只有拼接型XBP－1蛋白升高可增強(qiáng)FASN、ACC mRNA表達(dá)，繼而使ADRP表達(dá)升高，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，提示XBP－1蛋白的拼接是引起腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)合成增多的機(jī)制之一。Sha等人的研究也證實(shí)XBP－1基因敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和3T3－L1細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的脂質(zhì)生成障礙［14］。綜上所述，腎小管上皮細(xì)胞拼接型XBP－1蛋白升高可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，可能是多種腎臟疾病出現(xiàn)脂質(zhì)沉積的機(jī)制之一。

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