翁睿光 章劍劍 汪 琳

（1武漢市第五醫(yī)院神經(jīng)外科 武漢430050；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430071）

缺血后血流恢復(fù)可導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，稱(chēng)為缺血－再灌注損傷。腦缺血引起細(xì)胞反應(yīng)性損傷，是腦損傷的一種形式，再灌注后損傷加重。缺血－再灌注損傷由氧自由基堆積、炎性反應(yīng)、谷氨酸和鈣超載介導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)［1－3］。細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦缺血－再灌注損傷的主要機(jī)制［4］，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)再生能力影響神經(jīng)組織損傷修復(fù)和功能恢復(fù)［5］。不同年齡階段動(dòng)物對(duì)缺血－再灌注損傷的病理生理反應(yīng)不同，老年動(dòng)物的反應(yīng)更復(fù)雜［6］。本實(shí)驗(yàn)利用全腦缺血再灌注動(dòng)物模型，比較缺血再灌注后，青年鼠（2月齡）老年鼠（18月齡）海馬區(qū)齒狀回神經(jīng)組織的細(xì)胞凋亡與神經(jīng)再生能力的變化。

材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

2月齡青年雄性ICR小鼠15只，體重35－45g；18月齡老年雄性ICR小鼠15只，體重50－60g，動(dòng)物來(lái)源武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用隨機(jī)數(shù)字分組法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為青年假手術(shù)組、青年缺血－再灌注（I／R）組、老年假手術(shù)組和老年缺血－再灌注（I／R）組，I／R組動(dòng)物隨機(jī)分為I／R 3d組和缺血－再灌注I／R 7d組，每組5只動(dòng)物。

2．主要試劑

兔抗－Bax多克隆抗體（SANTA CRUZ公司），抗－nestin單克隆抗體、抗－doublecortin（DEX）單克隆抗體、抗－caspase9單克隆抗體和抗－Bcl2單克隆抗體（CHEMICON公司），ECL檢測(cè)試劑盒（Amersham公司）。

3．全腦缺血再灌注損傷模型的制備

全腦缺血再灌注模型采用二血管加低血壓法制作，腹腔注射12%烏拉坦按1．0g／kg麻醉后，將小鼠仰臥固定，經(jīng)頸正中切口，分離雙側(cè)頸動(dòng)脈并套以“0”號(hào)絲線，將雙側(cè)頸動(dòng)脈同時(shí)結(jié)扎阻斷，解剖顯微鏡下觀察動(dòng)脈完全變白確定無(wú)血流通過(guò)，30min后切斷絲線灌流10min，再次阻斷30min后，放開(kāi)線，使血流再通。阻斷的同時(shí)，在距尾尖1．5cm處剪斷放血，放血量小于體重的6%，以造成全腦低灌流，放血后熱凝止血。術(shù)畢腹腔注射生理鹽水1ml。假手術(shù)組的麻醉、手術(shù)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程與完全相同，但不阻斷頸總動(dòng)脈，不放血。I／R組再灌注3d、7d后取材。

4．蛋白免疫印跡分析

各組動(dòng)物斷頭處死，取腦組織，迅速分離海馬組織，將各組動(dòng)物的海馬組織勻漿取上清，蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS－PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜；正常血清封閉后分別與一抗、二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯色反應(yīng)后，拍照。

5．圖像分析

采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度測(cè)定分析，以目的條帶與內(nèi)參β－actin的平均光密度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平，每組數(shù)據(jù)來(lái)自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，利用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)均數(shù)進(jìn)行方差分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．缺血－再灌注對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：青年組海馬區(qū)Bcl－2表達(dá)較老年組高（P＜0．01），與假手術(shù)組比較，青年組和老年組缺血－再灌注后，海馬區(qū)Bcl－2表達(dá)降低，I／R 3d組明顯降低（P＜0．01）；（圖1）。老年組海馬區(qū)BAX表達(dá)較青年組高（P＜0．05）；與假手術(shù)組比較，缺血－再灌注3d后（I／R 3d），海馬區(qū)BAX表達(dá)顯著升高（P＜0．01）（圖2）。與假手術(shù)組比較，老年組缺血－再灌注后海馬區(qū)caspase－9表達(dá)升高，I／R 3d組顯著升高（P＜0．01）；缺血－再灌注3d（I／R 3d組）老年組海馬區(qū)caspase－9表達(dá)較青年組高（P＜0．01）（圖3）。

圖1 缺血－再灌注后，海馬組織中Bcl－2的表達(dá)（ˉx±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印跡Fig．1Expressions of Bcl－2in the hippocampus after I／R（ˉx±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

圖2 缺血－再灌注后，海馬組織中BAX的表達(dá)±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印跡Fig．2Expressions of BAX in the hippocampus after I／R±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

圖3 缺血－再灌注后，海馬組織中Caspase－9的表達(dá)（±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印跡Fig．3Expressions of Caspase－9in the hippocampus after I／R（±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

2．缺血－再灌注對(duì)海馬神經(jīng)元再生的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，青年組缺血－再灌注后，海馬區(qū)nestin表達(dá)I／R 3d升高（P＜0．05），I／R 7d顯著升高（P＜0．01）；老年鼠缺血－再灌注后nestin表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（P＞0．05）；與老年組比較，青年組（I／R 3d，I／R 7d組）海馬區(qū)nestin表達(dá)顯著升高（P＜0．01）（圖4）。青年組海馬區(qū)DCX表達(dá)較老年組高（P＜0．01）；與假手術(shù)組比較，青年組缺血－再灌注后DCX表達(dá)降低（P＜0．01），I／R 7d組較I／R 3d組升高（P＜0．05）；老年組缺血－再灌注后DCX表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0．05）（圖5）。

圖4 缺血－再灌注后，海馬組織中nestin的表達(dá)（±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印跡Fig．4Expressions of nestin in the hippocampus after I／R（ˉx±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

圖5 缺血－再灌注后，海馬組織中DCX的表達(dá)±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印跡Fig．5Expressions of DCX in the hippocampus after I／R（x±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

討 論

Bax和Bcl－2是Bcl－2基因家族中一對(duì)重要的促凋亡因子和抑凋亡因子。Bcl－2通過(guò)阻斷細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞存活，維持細(xì)胞生存；而B(niǎo)ax與Bcl－2功能相反，可形成同源二聚體，作為線粒體膜上離子通道的組成部分，使細(xì)胞色素C得以穿過(guò)線粒膜，并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與形成凋亡啟動(dòng)復(fù)合體，激活caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)DNA斷裂及多種細(xì)胞蛋白成分的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。Bcl－2和Bax的表達(dá)強(qiáng)度決定細(xì)胞命運(yùn)，Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞死亡，Bcl－2占優(yōu)勢(shì)時(shí)阻止細(xì)胞死亡。高表達(dá)的Bcl－2可使去除神經(jīng)生長(zhǎng)因子的交感神經(jīng)元繼續(xù)存活，而B(niǎo)ax的過(guò)表達(dá)則能對(duì)抗Bcl－2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用［7］。Bcl－2與Bax表達(dá)的比例決定著細(xì)胞在受到凋亡刺激信號(hào)后是生存還是死亡，因此調(diào)節(jié)二者基因表達(dá)對(duì)腦缺血具有重要的治療潛力［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血－再灌注導(dǎo)致青年組和老年組動(dòng)物海馬區(qū)Bax，caspase－9表達(dá)升高，Bcl－2降低，證實(shí)細(xì)胞凋亡是引起神經(jīng)元損傷的主要原因；腦缺血－再灌注導(dǎo)致的Bax表達(dá)升高，老年組明顯高于青年組，提示老齡增強(qiáng)海馬區(qū)對(duì)缺血－再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。

成年哺乳動(dòng)物，包括鬛齒類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)和人海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)有神經(jīng)干細(xì)胞分布，成體神經(jīng)干細(xì)胞始終保持有增殖能力，并且能誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞系［9］，海馬齒狀回神經(jīng)再生能力隨年齡增長(zhǎng)降低［10］。腦缺血能促進(jìn)成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，由成神經(jīng)區(qū)向缺血灶遷移，提示腦缺血損傷具有自我修復(fù)的能力［11］。Nestin是一種中間絲蛋白，表達(dá)于未成熟的神經(jīng)元，出生11d大鼠的腦皮質(zhì)中nes－tin消失［12］；nestin在成體神經(jīng)干細(xì)胞中有表達(dá)，與成體神經(jīng)再生相關(guān)。Doublecortin（DCX）是一種微管相關(guān)蛋白，在鼠胚中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較高表達(dá)，表達(dá)于遷移中的成神經(jīng)元細(xì)胞，與神經(jīng)元塑性、軸突形成、突觸建立相關(guān)［13］。因此，Nestin和DCX用以作為成體神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記分子。成體海馬齒狀回神經(jīng)再生經(jīng)歷五個(gè)階段：成神經(jīng)細(xì)胞增生，成神經(jīng)細(xì)胞分化期，神經(jīng)元移行，軸突和樹(shù)突靶向，突觸集成。Nestin作為神經(jīng)再生標(biāo)記表達(dá)于表達(dá)于成體神經(jīng)再生早期，DCX的表達(dá)于神經(jīng)元樹(shù)突軸突延伸階段［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血－再灌注損傷導(dǎo)致青年組海馬區(qū)nestin表達(dá)升高，老年組未見(jiàn)顯著變化，提示老齡動(dòng)物腦缺血－再灌注損傷的自我修復(fù)能力降低。缺血－再灌注3d，7d后DCX表達(dá)均低于假手術(shù)組，提示缺血－再灌注損傷影響神經(jīng)元塑性，但青年組海馬區(qū)DCX表達(dá)較老年組高，進(jìn)一步證實(shí)老齡動(dòng)物缺血－再灌注損傷后，海馬區(qū)神經(jīng)再生能力降低，影響組織損傷的自我修復(fù)能力。

綜上所述，神經(jīng)組織對(duì)缺血－再灌注損傷的修復(fù)決定于細(xì)胞凋亡、神經(jīng)再生能力，隨年齡增長(zhǎng)，由于成體海馬區(qū)神經(jīng)再生能力降低，，因此缺血－再灌注導(dǎo)致老齡鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生能力降低，細(xì)胞凋亡反應(yīng)增強(qiáng)，影響組織修復(fù)和功能恢復(fù)。

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