敖 鋒 沈 艷 吳 艷 萬 瑜 宋 健，＊

（1武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；2武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中心，武漢430071）

臨床和流行病學(xué)調(diào)查證實，絕經(jīng)或卵巢切除后女性冠心病發(fā)病率明顯增高，這一現(xiàn)象提示雌激素對女性心血管系統(tǒng)具有保護(hù)效應(yīng)。但2002年美國的一項對接受雌激素＋孕酮補(bǔ)充治療的絕經(jīng)后婦女隨機(jī)、雙盲和對照試驗（women’s health initiative，WHI）提示：雌激素補(bǔ)充治療總體上引起心血管疾病和中風(fēng)的風(fēng)險增高［1］。這一結(jié)論引發(fā)了一場有關(guān)雌激素補(bǔ)充治療利弊的論戰(zhàn)。通過近13年的爭論及對WHI原始資料后續(xù)詳細(xì)的分析，目前更新的WHI結(jié)論是：在接近絕經(jīng)或絕經(jīng)早期開始給予雌激素補(bǔ)充治療可減少女性冠心病的發(fā)病率；但對于絕經(jīng)時間已較長或年齡＞60歲的婦女，雌激素補(bǔ)充治療的這種保護(hù)效應(yīng)喪失［2］。WHI的這一更新結(jié)論雖然得到了廣泛認(rèn)可，但卻引出了一個更具挑戰(zhàn)性的疑問：既然雌激素補(bǔ)充治療對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，為什么用于絕經(jīng)時間較長的老齡婦女時會失效呢？

眾所周知，雌激素的效應(yīng)是通過其受體（estrogen receptor，ER）介導(dǎo)的，其中 ERα在介導(dǎo)心血管保護(hù)效應(yīng)中占主導(dǎo)地位［3－5］。由此，我們推測：在絕經(jīng)晚期的或老齡婦女，很可能由于雌激素的長時間缺失而導(dǎo)致ERα基因失活，故重新補(bǔ)充雌激素難以發(fā)揮ERα介導(dǎo)的心血管保護(hù)效應(yīng)。為檢驗這一假設(shè)，研究檢測了成年、老年雌性大鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）ERα的表達(dá)及補(bǔ)充雌激素對表達(dá)水平的影響，并從表觀遺傳學(xué)角度探討了其調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1．主要材料和試劑

成年（2－3月齡）和老年（≥20月齡，相當(dāng)于人類60歲以上）雌性Sprague－Dawley大鼠由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供。17β－雌二醇（E2；E4389；Sigma）、無酚紅培養(yǎng)基 DMEM／F－12（GNM11039；GIBCO）、炭吸附特級胎牛血清（1351579；Biological Industries）、兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體（SM MHC；P00009；Abcam）及ERα抗體（ab37438；Abcam）等均通過商品化途徑購置。

2．VSMC的培養(yǎng)及鑒定

采用酶消化法從成年、老年雌性大鼠主動脈分離VSMC，分別在無 E2或有10－10mol／L 、10－8mol／L（10－8mol／L 相當(dāng)于妊娠大鼠最高血漿濃度）E2存在下培養(yǎng)至3－4代。培養(yǎng)的VSMC經(jīng)SM MHC免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。

3．RT－qPCR檢測ERαmRNA表達(dá)

用TRIzol Reagent提取細(xì)胞總RNA，按照RevertAid H Minus Reverse Kit使用說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。ERα基因 RT－qPCR擴(kuò)增引物序列為［6］：上 游 5＇－AATTCTGACAATCGACGCCAG－3＇，下游5＇－GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC－3＇。內(nèi)參GAPDH的引物序列為：上游5＇－GATGGGTGTGAACCACGAGAAA－3＇，下 游 5＇－ACGGATACATTGGGGGTAGGA－3＇。以cDNA 為模板，按照SYBR Green SuperRealPreMix Plus說明書步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15min，然后依次進(jìn)入95℃10s，57℃30s，72℃20s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10s。

4．Western blot檢測ERα蛋白表達(dá)

常規(guī)提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS－PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)抗ERα（一抗）及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）作用后，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，Quantity One進(jìn)行相對定量分析，ERα蛋白表達(dá)水平用目的條帶與內(nèi)參GAPDH的灰度比值表示。

5．BSP法檢測ERα基因啟動區(qū)甲基化水平

按照 TIANamp Genomic DNA kit使用說明提取基因組DNA并進(jìn)行甲基化修飾。修飾后的產(chǎn)物采用 Wizard DNA Clean－up System 提供的方法純化及去磺基化后直接行PCR擴(kuò)增。應(yīng)用在線CpG島分析工具M(jìn)ethPrimer設(shè)計ERα基因啟動區(qū)甲基化引物：上游5＇－TTGTAAATTTAGTTTTTTTTGGAGTG－3＇，下 游 5＇－ACTAATCTCCCCTATTCTTAAACATC－3＇。 反 應(yīng) 條 件 為：95 ℃ 預(yù) 變 性2min，然后95℃30s，57℃30s，72℃25s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸3min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，凝膠純化試劑盒回收目的片段，鏈接T載體后測序，測序結(jié)果導(dǎo)入DNAMAN軟件進(jìn)行比對，計算CpG島甲基化率。

6．統(tǒng)計學(xué)分析

DNA甲基化率數(shù)據(jù)采用 Mann－Whitney U檢驗、其它數(shù)據(jù)采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分析軟件為Graphpad Prism 5。P＜0．05表示差別具有顯著性。

結(jié) 果

1．VSMC的鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，分離培養(yǎng)的成年、老年雌性大鼠VSMC均高表達(dá)SM MHC，陽性細(xì)胞率在90%以上（圖1）。

圖1 VSMC免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定（×400）。紅色熒光：SM MHC染色（Cy3）；藍(lán)色熒光：Hochest核染。Fig．1Immunocytochemical identification of cultured VSMCs from adult and old female rats（×400）．Red：SM MHC staining（Cy3）；Blue：Neuclei counterstaining with Hochest．

2．ERα的表達(dá)

RT－qPCR和 Western blot分析顯示（圖2A、圖2B）：無E2存在時，成年雌性大鼠VSMC表達(dá)一定水平ERα。當(dāng)加入生理劑量E2時，ERα表達(dá)隨E2濃度增加顯著上升，其中10－10mol／L E2組約上升至1．75倍，10－8mol／L E2組約上升至2．5倍。

老年雌性大鼠VSMC在無E2存在時，無論是mRNA還蛋白質(zhì)水平幾乎均檢測不到ERα，且即使補(bǔ)充E2達(dá)最高生理劑量（10－8mol／L）也無法誘導(dǎo)ERα的重新表達(dá)。

圖2 ERα在成、老年VSMC中的表達(dá)。A：ERαmRNA的表達(dá)（實時熒光定量PCR檢測）；B：ERα的蛋白表達(dá)（Western blot檢測）。＊P＜0．05，與同E2劑量組成年大鼠VSMC比較；△P＜0．05，與前一E2劑量組同齡大鼠VSMC比較。n＝5Fig．2Expression of ERαin VSMCs at mRNA and protein levels．A：RT－qPCR analysis for ERαmRNA expression．B：Western blot analysis for ERαprotein expression．＊P＜0．05，compared with the adult VSMCs in the same E2－dose group；△P＜0．05，compared with the same－aged VSMCs in the adjacent previous E2－dose group．N＝5

3．ERα基因啟動區(qū)CpG島甲基化水平的變化

用MethPrimer對ERα基因DNA序列分析顯示：在ERα基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域存在著一個典型的CpG島（圖3A），本研究分析了CpG島及其附近CpG位點的甲基化（圖3B）。

如圖3C所示，無E2存在時，成年雌性大鼠VSMC ERα基因啟動區(qū)CpG島呈現(xiàn)較低水平的甲基化（＜20%）；加入10－8mol／L E2后，甲基化水平顯著下降。而老年雌性大鼠VSMC在無E2存在時ERα基因啟動區(qū)CpG島甲基化水平高達(dá)80%以上，且加入10－8mol／L E2對甲基化水平無顯著影響。

圖3 成、老年大鼠VSMC ERα基因啟動區(qū)甲基化水平的BSP分析。A：BSP引物在ERα基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的位置。上方水平細(xì)線顯示ERα基因啟動區(qū)及其CpG島的位置，下方水平粗線顯示BSP檢測的位置（﹣634－﹣397），其中垂直線段為CpG位點。B：ERα基因啟動區(qū)CpG島（方框內(nèi)）及其附近CpG位點甲基化水平；每一橫行代表一個克隆的不同CpG位點，每一縱列代表不同克隆的相同CpG位點；空心圓和實心圓分別代表未甲基化和甲基化的CpG位點。C：CpG島甲基化水平比較。＊P＜0．05，與同E2劑量組成年大鼠 VSMC比較；△P＜0．05，與0mol／L E2組同齡大鼠 VSMC比較。n＝10Fig．3BSP analysis for methylation level of ERαgene promoter in the VSMCs．A：BSP primer locations in the promoter regions of the rat ERαgene．The upper thin horizontal line represents the ERαpromoter with a CpG island．The lower bold horizontal line represents the BSP examined region（－634to－397），the CpG sites indicated by vertical ticks．B：Methylation status of CpG island（framed by agrey box）and adjacent CpG sites in ERαgene．Each row represents CpG sites in an individual clone and each column，the same CpG sites in different clones．White dots represent unmethylated CpG sites，and black，methylated．C：Histogram of methylated CpG sites in the CpG island；＊P＜0．05，compared with the adult VSMCs in the same E2－dose group，△P＜0．05，compared with the same－aged VSMCs in the 0mol／L E2group．n＝10

討 論

研究以培養(yǎng)的成年和老年雌性大鼠VSMC為模型，體外給予生理劑量雌激素模擬成年及絕經(jīng)后老齡婦女雌激素補(bǔ)充治療。為排除環(huán)境微量雌激素的干擾，采用了含10%活性炭吸附特級胎牛血清、無酚紅的完全培養(yǎng)基。

結(jié)果顯示：成年大鼠VSMC無論在有或無雌激素存在時均表達(dá)ERα，且表達(dá)水平隨雌激素濃度增加而上升。這提示成年大鼠VSMC不僅表達(dá)ERα，且表達(dá)水平受體內(nèi)雌激素水平的誘導(dǎo)或調(diào)控。而老年雌性大鼠VSMC無論是在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均檢測不到ERα表達(dá)，即使補(bǔ)充雌激素達(dá)最高生理劑量也無法誘導(dǎo)ERα的重新表達(dá)，提示在月齡≥20的雌性大鼠，VSMC的ERα基因已經(jīng)永久失活。

為探討老年雌性大鼠VSMC ERα基因失活的機(jī)制，本研究進(jìn)一步對比分析了兩個年齡組VSMC在有或無雌激素存在條件下ERα基因啟動區(qū)CpG島甲基化水平的變化。結(jié)果提示：成年雌性大鼠VSMC ERα基因本身存在低水平CpG島甲基化（＜20%），但給予雌激素后，甲基化水平顯著降低，說明雌激素對ERα表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)是通過影響其基因甲基化來實現(xiàn)的。但老年雌性大鼠VSMC ERα基因啟動區(qū)CpG島甲基化已高達(dá)80%以上，且加入最高生理劑量雌激素也不逆轉(zhuǎn)。這說明老年雌性大鼠VSMC ERα基因的失活可能是由于年齡相關(guān)的生理因素變化（特別是雌激素長期缺失）導(dǎo)致其啟動區(qū)CpG高度甲基化所致。

臨床研究表明，絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平明顯下降，到絕經(jīng)后期由于卵泡耗竭，卵巢停止分泌雌激素［7］，引起內(nèi)源性雌激素嚴(yán)重缺乏。Christopher等報道，內(nèi)皮細(xì)胞ERα的激活依賴于雌激素，且表達(dá)水平受雌激素的調(diào)控，短期雌激素的缺失即會引起ERα的表達(dá)驟減［8］，這證據(jù)支持ER的表達(dá)與雌激素水平息息相關(guān)，老年雌性機(jī)體組織中ERα的失活很可能是雌激素長期缺乏所致。Post等［9］研究發(fā)現(xiàn)心血管組織ERα基因的甲基化與年齡相關(guān)，年齡越大，啟動子的甲基化水平越高，且老年動物心血管組織的ERα基因因DNA高甲基化而失活。這些研究雖與本研究采用的動物或細(xì)胞類型不同，研究的側(cè)重點也不同，但獲得的證據(jù)支持本研究結(jié)論，即成年雌性大鼠VSMC ERα的表達(dá)受雌激素水平的調(diào)控；老年雌性大鼠VSMC由于內(nèi)源性雌激素的長期缺失，導(dǎo)致VSMC ERα基因發(fā)生高水平甲基化而沉默。

已有眾多研究顯示，雌激素的血管保護(hù)作用之一是抑制VSMC增殖，從而防止或延緩動脈粥樣硬化早期出現(xiàn)的內(nèi)膜增厚，而這一效應(yīng)主要由ERα介導(dǎo)［5］。由此我們推測：對于絕經(jīng)早期的婦女，補(bǔ)充雌激素可誘導(dǎo)ERα表達(dá)升高并介導(dǎo)其抗動脈粥樣硬化作用；但在絕經(jīng)晚期或老齡婦女，由于ERα已失活，重新補(bǔ)充雌激素難以發(fā)揮ERα介導(dǎo)的血管保護(hù)效應(yīng)。

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