黃孔文，王海彥，韋葉生，廖品琥，熊濱，李軍，黃冰，胡東海，仇曉文

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 百色 533000 E－mail：416437185＠qq.com；2.廣東省婦幼保健院麻醉科，廣東 廣州 511400；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000；4.廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧 530021；5.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530021）

IL－10是具有多效應(yīng)功能的抗炎細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［1－2］。可以通過抑制巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞等細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)，從而抑制促炎因子的合成和釋放，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)平衡，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［3］。

IL－10的基因位于1號(hào)染色體的長臂端，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子［4］，其啟動(dòng)子區(qū)域的幾個(gè)SNP位點(diǎn)與IL－10的表達(dá)水平密切相關(guān)［5］。內(nèi)含子堿基發(fā)生位點(diǎn)突變后，可能導(dǎo)致基因重組、外顯子重復(fù)或者外顯子再現(xiàn)，從而提高了特異功能結(jié)構(gòu)域的劑量，這樣可能影響蛋白質(zhì)的活性及表達(dá)劑量［6］。本研究通過對(duì)廣西地區(qū)人群IL－10 基因第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)的rs3021094T／G 位點(diǎn)的研究，探討其基因型和等位基因的頻率分布，并與人類基因組計(jì)劃研究的4個(gè)人群（歐洲、非洲、中國北京、日本）（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／projects／SNP／）以及臺(tái)灣地區(qū)人群SNP分型數(shù)據(jù)比較，以分析研究IL－10基因內(nèi)含子區(qū)SNP分型在不同地區(qū)、種族人群之間的分布差異。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 在知情同意的基礎(chǔ)上，選取199例廣西地區(qū)中臨床指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)室檢查均在正常范圍內(nèi)的健康體檢者，其中男118例，女81例，平均年齡為（54.0±14.61）歲。確認(rèn)無器質(zhì)性疾病，且無血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備 用EDTA－K2抗凝采血管收集每位參與者的外周靜脈血2 ml，使用改良碘化鈉方法提取DNA，在－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多態(tài)性位點(diǎn)基因型分析 采用單堿基延伸PCR 分析方法檢測(cè)IL－10基因第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)域rs3021094T／G 的基因型。PCR 引 物 通 過 在 線Primer3 軟 件 設(shè) 計(jì)（http：／／frodo.wi.mit.edu／cgi－bin／primer3／primer3＿www.cgi），并由上海天昊生物科技有限公司合成。其中rs3021094T／G 位點(diǎn)的上游引物序列為：5’－AAATTGGCTCTGGCCCAAAAAA－3’，下游：5’－GGAAGCACTCTACATGAGGGAAACCT－3’，擴(kuò)增片 段 長 度 350bp， 延 伸 引 物 序 列 是：5’－TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGA CCATCACTTAAATCAGGTCCTCC－3’。

1.2.3 PCR 反 應(yīng) 采 用20 μl擴(kuò) 增 反 應(yīng) 體 系，其 中 包 含1xHotStarTaq緩沖液、多重PCR 引物、HotStarTaq 聚合酶（Qiagen Inc.）、3.0mmol／L 鎂離子、0.3mmol／L dNTP、DNA模板。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性15s，65～0.5℃退火40s，72 ℃延伸1min的順序重復(fù)11個(gè)循環(huán)；然后以94℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸1min的順序重復(fù)24個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min。PCR 產(chǎn)物用蝦堿酶（Promega）和外切酶I（Epicentre）純化后進(jìn)行延伸反應(yīng)（SNaPshot Multiplex kit，ABI），延伸產(chǎn)物純化后用ABI3130XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用GeneMapper 4.1（Applied biosystems）進(jìn)行分型分析（由上海天昊生物科技有限公司承做）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究結(jié)果用SSPS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間基因型及等位基因的分別情況、計(jì)數(shù)資料的比較均采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果 本研究采用單堿基延伸PCR 技術(shù)對(duì)IL－10基因內(nèi)含子區(qū)rs3021094T／G 位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，SNP分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs3021094T／G 位點(diǎn)存在TT、GT、GG 三種基因型。并通過基因測(cè)序驗(yàn)證了此結(jié)果，見圖1。

圖1 IL－10基因rs3021094T／G 位點(diǎn)測(cè)序圖

2.2 SNP 分型結(jié)果 通過分析IL－10基因第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)rs3021094T／G 位點(diǎn)SNP分型數(shù)據(jù)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，IL－10基因第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)rs3021094T／G 位點(diǎn)基因型及等位基因的頻率在男性、女性兩組之間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表1，符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，具有人群代表性。其中，rs3021094T／G 位點(diǎn)以GT 基因型多見，占51.76%，以G 等位基因較為常見，占53.52%。

2.3 不同地區(qū)、種族人群間的比較 通過對(duì)廣西地區(qū)人群與人類基因組計(jì)劃研究的4個(gè)人群（歐洲、非洲、中國北京、日本）及臺(tái)灣［7］地區(qū)人群SNP分型數(shù)據(jù)的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL－10基因內(nèi)含子區(qū)rs3021094T／G 位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布與歐洲、非洲地區(qū)人群相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而與日本、中國北京、臺(tái)灣地區(qū)人群分布相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2。

表1 IL－10基因rs3021094T／G 位點(diǎn)在廣西地區(qū)人群中的分布情況 （n，%）

表2 IL－10基因rs3021094T／G 位點(diǎn)多態(tài)性在不同地區(qū)、種族人群的分布情況 （n，%）

3 討論

IL－10基因表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，IL－10基因定位于第1號(hào)染色體q31～32，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子［4］，在細(xì)胞和血漿中IL－10水平很低，而當(dāng)機(jī)體受到外界刺激或者患有某些疾病后，其表達(dá)水平將大大增加，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗炎反應(yīng)。炎癥反應(yīng)中，IL－10可能起到重要的反饋重要，以控制機(jī)體避免發(fā)生瀑布樣炎癥反應(yīng)。IL－10的免疫抑制作用，使其對(duì)部分抗原有免疫耐受作用，在病原體清除中起到作用，如果IL－10水平過高或者功能紊亂，都會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥的形成［8］。

目前對(duì)IL－10 多態(tài)性的研究主要集中在啟動(dòng)子區(qū)的－1082（G／A）、－819（C／T）、－592（C／A），其他大部分主要位于非編碼區(qū)的內(nèi)含子［9］。國內(nèi)外研究顯示，IL－10基因多態(tài)性影響IL－10的自身產(chǎn)生，與多種疾病相關(guān)。IL－10的－819（C／T）與強(qiáng)直性脊柱炎呈顯著相關(guān)性趨勢(shì)（P ＝0.054）［10］；IL－10基因啟動(dòng)子－592（C／A）多態(tài)性對(duì)血脂異常有一定影響［11］；IL－10 1082（A／G）基因多態(tài)性與膿毒癥易感性有關(guān)［12］。

內(nèi)含子主要通過選擇剪接使單一基因產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，在不同的水平影響基因表達(dá)，其中包括影響轉(zhuǎn)錄、mRNA 輸出及翻譯效率等［13］。rs3021094T／G 位點(diǎn)位于IL－10 基因的第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)，其基因多態(tài)性可能在基因的表達(dá)中起著重要的調(diào)節(jié)作用［14］，可能影響IL－10基因的功能，而IL－10基因功能的變化可能與某些疾病發(fā)病情況有關(guān)，使不同地區(qū)、種族的人群對(duì)疾病的易感性及發(fā)病率不同。

通過對(duì)比分析IL－10第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)rs3021094T／G 位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs3021094T／G 位點(diǎn)以GT 基因型（51.76%）較為多見，rs3021094T／G 位點(diǎn)的等位基因（G、T）在本研究人群中分布比較接近。rs3021094T／G 位點(diǎn)基因型及等位基因的分布頻率在男性、女性間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。本研究人群的rs3021094T／G 位點(diǎn)基因型及等位基因的分布頻率與歐洲、非洲地區(qū)人群的T、G 等位基因分布頻率比較接近；而歐洲、非洲地區(qū)人群中在rs3021094T／G 位點(diǎn)以TT 基因型（各占86.67%和100%）最為常見，以T 等位基因最為常見（各占93.33%和100%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而與日本、中國北京、臺(tái)灣地區(qū)人群的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。研究結(jié)果提示，IL－10 基因內(nèi)含子區(qū)SNP分型在不同地區(qū)及種族之間存在差異，這種差異可能與自然環(huán)境、生活環(huán)境以及種族的差異有關(guān)。

4 結(jié)論

IL－10基因內(nèi)含子區(qū)基因多態(tài)性在不同地區(qū)、種族人群之間的分布有差異。

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