陳健明，吳成將，藍(lán)艷，向陽，羅宏成，韋葉生②

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院2011級檢驗本科，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 百色 533000）

CD40L是一種Ⅱ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，表達(dá)于免疫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等多種細(xì)胞上，參與免疫、炎癥、高凝等多種病理生理狀態(tài)的調(diào)控，與其配體CD40 分子相互作用，在腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞、免疫應(yīng)答反應(yīng)和細(xì)胞的分裂增殖調(diào)控等方面發(fā)揮著日益重要 作 用［1－3］。編 碼CD40L 的 基 因 位 于 染 色 體Xq26 上。CD40L基因存在著基因變異及基因多態(tài)性，這種基因的變異和多態(tài)性與人類動脈粥樣硬化性疾病、X－連鎖高IgM 綜合征（XHIM）、阿爾茨海默氏病及格雷夫斯?。℅D）的聯(lián)系，已經(jīng)逐步成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點［4－8］。為此，我們采用DNA序列測定法和單堿基延伸PCR 技術(shù)，對CD40L 基因進(jìn)行多態(tài)性研究，對認(rèn)識遺傳因素的發(fā)病作用具有重大意義；同時，確定其在正常人群中的分布，將為人類遺傳學(xué)的研究提供基礎(chǔ)性的資料。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機選取在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢健康者，且相互間無血緣關(guān)系。廣西地區(qū)壯族人199例，其中男116例，女83例，年齡25～83 歲；漢族199例，其中男108例，女91例，年齡22～86歲。血常規(guī)、空腹血糖及其他生化指標(biāo)均在參考值范圍內(nèi)，心電圖檢查正常，排除腎臟、肝臟、內(nèi)分泌及心腦血管等疾病。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采集體檢健康者靜脈血3ml，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝；采用已建立的PaxGene血液DNA 提取試劑盒［9］進(jìn)行白細(xì)胞的基因組DNA 的提取，在－70 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)CD40L 基因位點rs1126535C／T 多態(tài)性及已知的DNA 序列設(shè)計PCR 引物，引物的合成由上海天昊生物科技有限責(zé)任公司完成。采用特異性擴增CD40L基因位點rs1126535C／T 堿基的DNA 片段的引物，上游引物序列為：5′－ GGACTGCCCATCAGCATGAAA－3′；下游引物序列為：5′－TCCATCATTTGGGTAGAACCAACCT－3′；延 伸 引 物 序 列 為：5′－TTTTTTTTTTTTACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGG－3′。

1.2.3 PCR 擴增 CD40的PCR 擴增反應(yīng)體系為20μl，其中含10×PCR 緩沖液2.0μl，0.3mmol／L dNTPs 2.0μl，上、下游引物各1.0μl，模板DNA 1.0μl，TaqDNA 聚合酶1.0u，不足體積用經(jīng)過兩次標(biāo)準(zhǔn)程序高壓滅菌的雙蒸水補足至20μl。PCR 產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR 獲得，PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶（SAP）（from Promega）和外切酶Ⅰ（EXOⅠ）（from Epicentre）純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用蝦堿酶（SAP）（from Promega）純化后在ABI3130XL 上樣。單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）來分析。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，以率來表示計數(shù)資料。等位基因和基因型的頻率采用基因直接計數(shù)法來計算，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法對各組間等位基因和基因型的頻率進(jìn)行對比，以P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD40L基因型檢測結(jié)果 CD40L 基因rs1126535C／T 多態(tài)性，PCR 擴增產(chǎn)物片段大小為190bp。經(jīng)ABI3130XL 基因檢測儀SNP分型結(jié)果顯示rs1126535C／T 位點檢測到CC、CT和TT 三種基因型。經(jīng)過基因測序后得到的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實我們所檢測到的結(jié)果，見圖1。

圖1 CD40L基因rs1126535C／T 測序圖

2.2 CD40L基因多態(tài)性在壯、漢兩民族人群中分布頻率的比較 計算廣西壯、漢兩民族健康人群中CD40L等位基因和基因型的頻率，采用χ2檢驗進(jìn)行計算，CD40L 基因rs1126535C／T位點的等位基因和基因型頻率均符合哈迪－溫伯格（Hardy－Weinberg）遺傳平衡定律，說明我們所選取的研究樣本具有群體代表性。其中rs1126535C／T 位點的基因型在廣西壯族和廣西漢族中均以TT 型最為多見，分別占88.44%和94.47%。其等位基因和基因型頻率分布在男女性別之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；廣西壯族及漢族人群中CD40L 基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見表1。

2.3 CD40L基因多態(tài)性在不同種族人群間的比較 廣西漢族人群CD40L基因型和等位基因頻率分別與歐洲人、日本人、非洲人比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；而與北京人及廣西壯族人比較基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

表1 廣西壯族和漢族人群CD40L基因rs1126535C／T基因型和等位基因分布頻率的比較 （n，%）

表2 不同種族及地區(qū)人群CD40L基因rs1126535C／T多態(tài)性分布頻率 （n，%）

3 討論

生物群體基因多態(tài)性現(xiàn)象十分普遍，其中，對人類基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能，研究比較深入?；蚨鄳B(tài)性研究為探索疾病的產(chǎn)生和發(fā)展機制以及表型多樣化產(chǎn)生的本質(zhì)開辟了一個全新的領(lǐng)域。在人類基因結(jié)構(gòu)和功能的研究成果日新月異的形勢下，對多基因參與的一些常見病，通過候選基因來綜合分析疾病的發(fā)病機制，從而有效預(yù)防疾病發(fā)生是未來預(yù)防醫(yī)學(xué)一個重要的研究方向，也是目前將人類基因結(jié)構(gòu)性研究成果應(yīng)用于預(yù)防醫(yī)學(xué)的一個較為現(xiàn)實的途徑。廣西是壯族的聚集地，通過對壯族和漢族兩個不同民族CD40L基因多態(tài)性的研究，有助于發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布規(guī)律，從而為探索一些疾病在不同種族間的遺傳規(guī)律，提供前瞻性的基礎(chǔ)資料。

CD40L又稱CD154 即CD40 的配體，屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，與CD40分子相互作用，在腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞、免疫應(yīng)答反應(yīng)和細(xì)胞的增殖調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。在上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等都有CD40L的表達(dá)，但主要表達(dá)于活化的CD4＋T 細(xì)胞和血小板。CD40L與高親和力的CD40 結(jié)合，對T／B 細(xì)胞活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生起誘導(dǎo)作用，可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子－1、E選擇素上調(diào)，吸引血中的白細(xì)胞向血管壁聚集［10］。CD40L還能促進(jìn)Aβ－42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)CD40和MHCⅡ分子顯著增加。促進(jìn)其向抗原提呈功能的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，繼而加劇對神經(jīng)元的損傷［11］，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。了解相關(guān)疾病的發(fā)病機制與CD40L多態(tài)性的關(guān)系，將為疾病的預(yù)防和臨床實踐提供理論依據(jù)。編碼CD40L基因位于X 染色體q26.3－q27.1上，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，其編碼蛋白產(chǎn)物含有266 個氨基酸。CD40L基因存在rs1126535C／T 的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），此種基因多態(tài)性的存在可能影響著CD40L基因的某些功能，進(jìn)而影響著同CD40L 有關(guān)疾病的產(chǎn)生和進(jìn)展，因而，對CD40L 基因多態(tài)性在不同種族和不同地域人群中分布規(guī)律的研究和分析，為持續(xù)研究CD40L基因多態(tài)性在不同種族人群中同某些疾病的產(chǎn)生以及進(jìn)展之間的相關(guān)性提供了一些分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)性資料。

本文通過采取了單堿基延伸PCR 技術(shù)（PCR－SBE）對來自廣西壯族自治區(qū)的壯族和漢族健康人群CD40L 基因rs1126535C／T 位點多態(tài)性的分布情況進(jìn)行檢測，從我們檢測的結(jié)果可以看出，在壯族人中CC 基因型5.53%、CT 基因型占6.03%、TT 基 因 型 占88.44%；在 漢 族 人 中CC 基 因 型 占1.51%、CT 基因型占4.02%、TT 基因型占94.47%。在廣西壯族及漢族人群中CD40L 基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其等位基因和基因型頻率分布在男女性別間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。我們將來自中國廣西壯族自治區(qū)的壯族和漢族人同來自歐洲、非洲、日本、北京等人群基因多態(tài)性研究結(jié)果進(jìn)行比較和分析后可以看出，在我國廣西壯族自治區(qū)的健康人群中，我們發(fā)現(xiàn)CD40L 基因rs1126535C／T 位點壯族的T 等位基因頻率（91.46%）和漢族T 等位基因的頻率（96.48%），均 明 顯 高 于 歐 洲 人（79.65%），高 于 北 京 人（90.70%），高于非洲人（88.05%），高于日本人（86.63%），其中歐洲人、日本人和非洲人與漢族人比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），廣西漢族人基因型分布頻率同北京人比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），而等位基因分布頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。出現(xiàn)這種情況的原因可能與所處的環(huán)境不同，飲食生活習(xí)慣等各異所致；從本文統(tǒng)計結(jié)果可以明顯看出，在不同種族中，CD40L 等位基因的頻率和基因型的分布頻率存在著明顯的差異。

總之，探索我國壯族與漢族人群中CD40L基因多態(tài)性的分布及其與相關(guān)疾病發(fā)病機制的關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布規(guī)律，為與CD40L相關(guān)疾病的預(yù)防及臨床實踐提供可靠理論依據(jù)；同時，確定其在正常人群中的分布，將為人類遺傳學(xué)的研究提供基礎(chǔ)性的資料。

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