范海濤 ，張虎成，曲 偉，王孟君，，劉欣欣，王鵬飛

1北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院，北京 100029;2 北京聯合大學，北京 100012;3軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100027

紅茶菌(Kombucha)又名海寶或胃寶，在我國民間很早就有培養(yǎng)和流傳，并作為一種日常飲用的傳統飲料。近年來，國內外醫(yī)學界的研究表明，紅茶菌對多種慢性疾病，如高血壓、冠心病、糖尿病等具有一定的療效［1］，由于紅茶菌的培養(yǎng)屬于共生菌的混合發(fā)酵過程，故培養(yǎng)液成分復雜，目前認為多種成分決定了紅茶菌培養(yǎng)液的活性。文獻報道［2，3］，紅茶菌培養(yǎng)液中含有較多的多糖類物質，并可能與香菇、靈芝和茯苓等真菌多糖類似，具有藥物活性。本課題組前期初步活性研究表明，紅茶菌多糖(Kombucha Polysaccharides，KPS)具有清除自由基的活性，與其他許多多糖活性相仿。

對紅茶菌多糖含量的測定已有相關報道，如:程江峰［4］以苯酚-硫酸法對紅茶菌多糖進行了含量測定，初步確定了測定條件。但是不同單糖與苯酚-硫酸試劑顯色情況不同，其標準曲線的斜率也不同，甚至有些糖差別很大［5］，因此單純用葡萄糖作標準曲線來計算多糖含量必然會存在較大誤差。為了開發(fā)利用紅茶菌多糖，需建立一種比經典方法更可行和準確的多糖部位中糖含量的測定方法。對于雜多糖，分析結果必須根據各單糖的組成比及各單糖的標準曲線的校正系數加以校正計算，才能獲得準確的結果，操作比較繁瑣［6］。針對這個問題，有學者采用測定換算因子的方法來消除單純以葡萄糖作標準曲線引起的誤差［7，8］，并用于植物來源多糖的含量測定。

紅茶菌培養(yǎng)液中多糖包括茶葉來源的植物多糖及發(fā)酵菌產生的細菌多糖和真菌多糖，其單糖組成及連接方式等相對較復雜，對苯酚-硫酸比色法進行含量測定的影響因素較多。本研究以精制紅茶菌多糖測得紅茶菌多糖對葡萄糖的換算因子，再以此校正采用苯酚-硫酸比色法測定的紅茶菌粗多糖部位的多糖含量，并進行方法學考察，確定測定紅茶菌多糖含量的快速、簡便、可靠的方法。

1 儀器與試藥

UV-5800 紫外/可見分光光度計，上海元析儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱，上海福瑪實驗設備有限公司;CARY50 全波長紫外掃描儀，瓦里安公司;旋轉蒸發(fā)儀，德國Heidolph;電子天平，奧豪斯公司;高速離心機，上海安亭科學儀器廠;冷凍干燥機，天津因賽科技發(fā)展有限公司。

祁紅茶葉，購于北京物美大賣場北苑店(產地福建省福安市福東茶廠);紅茶菌菌種為本實驗室保存;苯酚，為重蒸苯酚，購自北京鼎國生物技術有限責任公司;過氧化氫、葡萄糖、氯化鈉、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇等試劑均為分析純;濃硫酸為優(yōu)級純。

2 方法與結果

2.1 紅茶菌的培養(yǎng)

稱取4 g 紅茶，以1000 mL 的沸水煮20 min，加入50 g 葡萄糖，煮10 min，放涼后濾去茶葉補足水至1000 mL 作為紅茶菌培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基分裝、滅菌、接種、培養(yǎng)后得到紅茶菌培養(yǎng)液。

2.2 紅茶菌多糖的提取與精制

培養(yǎng)10 d 后的紅茶菌培養(yǎng)液，棄去菌膜，取菌液460 mL 沸水提取30 min，冷卻后3000 rpm 離心，取上清，50 ℃減壓濃縮至小體積，冷卻至室溫后加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數為80%，置于4℃冰箱中過夜，次日棄上清，并將沉淀揮干乙醇后以水溶解后再次離心，上清液再次以80%乙醇沉淀，4℃冰箱中過夜后棄上清，如此反復處理多次，直至目測多糖溶液無色，將多糖溶液以Sevag 法除蛋白多次，直至其在280 nm 處無明顯紫外吸收峰，除蛋白結束，濃縮水層得粗多糖溶液，冷凍干燥得紅茶菌粗多糖，為灰白色粉末51.8 mg，計算其得率為11.26 mg/100 mL。

將紅茶菌粗多糖先后用過氧化氫、透析處理，并以無水乙醇、丙酮反復洗滌8 次后真空冷凍干燥，即得紅茶菌精制多糖。本實驗室曾對該操作下的黑骨藤精制多糖進行了驗證，可保證多糖中基本不含其他雜質［9］。

2.3 標準曲線的繪制

2.3.1 苯酚溶液的配制

稱取苯酚36 g，加入蒸餾水24 mL，即為60%的苯酚溶液，冰箱中密封避光長期保存。

取密封避光保存的60%苯酚溶液，放置于室溫，精密移取5 mL 置于50 mL 的容量瓶中，定容，即為6%的苯酚溶液，臨用前現配。

2.3.2 葡萄糖標準系列溶液的配制

精密稱定105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖50 mg，蒸餾水定容于50 mL 容量瓶中，搖勻，配制成濃度為1 g/L 的儲備液。從儲備液中分別精密移取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0 mL 置于9個50 mL 容量瓶中，蒸餾水定容，配制成10、20、40、50、60、70、80、100、120 mg/L 的葡萄糖標準系列溶液。

2.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制

精密移取葡萄糖標準系列溶液各1.0 mL，空白取1.0 mL 水，分別置于50 mL 容量瓶中，各加6%的苯酚1.0 mL 后充分振搖，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，振搖，室溫放置40 min 后于490 nm 處測定吸光度，以葡萄糖濃度(C)對吸光度(A)進行線性回歸，在10～100 mg/L 范圍內得回歸方程C=131.58A -4.88，r=0.9997，葡萄糖對照品在此范圍內線性關系良好。

2.3.4 紅茶菌精制多糖標準系列溶液的配制

按照2.3.2 方法，將紅茶菌精制多糖配制成40、50、60、70、80 和100 mg/L 的標準系列溶液。

2.3.5 紅茶菌精制多糖標準曲線的繪制

按照2.3.3 方法，得紅茶菌精制多糖的回歸方程C=797.22A-6.26，r=0.9991，紅茶菌精制多糖在20～100 mg/L 范圍內的線性關系良好。

2.4 換算因子的計算

根據苯酚-硫酸法測定糖含量的原理，不同種類的糖與苯酚-硫酸試劑顯色情況不同，利用換算因子校正測定結果能夠較好地消除這個因素帶來的誤差，使結果更準確。

精密稱定紅茶菌精制多糖20.3 mg，蒸餾水定容于50 mL 容量瓶中，配制成濃度為406 mg/L 的儲備液。從中取出5 mL 置于25 mL 的容量瓶中，蒸餾水定容，配制成81.2 mg/L 的待測溶液。精密移取精制多糖的待測溶液1.0 mL，按照測定標準曲線的方法測定其吸光度，根據標準曲線計算其中的多糖濃度，按f=W/(C ×D)計算換算因子，其中W 為樣品配制濃度(mg/L)，C 為通過葡萄糖標準曲線計算出的多糖濃度(mg/L)，D 為樣品溶液稀釋的倍數，本實驗未進行稀釋，D=1，測得f=5.93(n=3)。

2.5 粗多糖溶液的配制

精密稱定紅茶菌粗多糖77.7 mg，定容于10 mL容量瓶中，從中精密移取2 mL，定容于50 mL 容量瓶中，配制成濃度為310.8 mg/L 的儲備液。從中取出10 mL 置于50 mL 的容量瓶中，定容，配制成62.2 mg/L 的待測溶液。

2.6 精密度試驗

精密移取紅茶菌粗多糖待測液1.0 mL，按測定標準曲線的方法測定其吸光度，平行測定6 份，得吸光度平均值為0.103，RSD 為4.2%(n=6)，表明此方法精密度良好。

2.7 顯色穩(wěn)定性試驗

精密移取紅茶菌粗多糖待測液1.0 mL，按測定標準曲線的方法分別于0、1、2、3、4 h 測定其吸光度，得吸光度平均值為0.108，RSD 為4.9%(n=5)。

2.8 加樣回收率實驗

精密吸取已知含量的紅茶菌粗多糖待測溶液1.0 mL 6 份，分別置于6 個25 mL 容量瓶中，分別加入葡萄糖標準系列溶液1.0 mL，按測定標準曲線的方法操作，按下式計算加樣回收率:R=［(M-P/f)/A］×100%，式中P 為加入的紅茶菌粗糖濃度62.1 mg/L;A 為葡萄糖加入量;M 為(A+P)藥量混合后進行回收實驗所得測定值經換算后得到的總糖量;f 為紅茶菌多糖-葡萄糖的換算因子5.93。測得平均加樣回收率為101.40%，RSD 5.03%，見表1。

表1 紅茶菌多糖加樣回收率實驗結果Table 1 Results of recovery test of Kombucha polysaccharides

2.9 紅茶菌粗多糖含量測定

精密移取粗多糖待測溶液1.0 mL，按照測定標準曲線的方法測定其吸光度，根據葡萄糖標準曲線計算其中的多糖濃度。多糖含量=CDf/W ×100%，計算得紅茶菌粗多糖部位中多糖的質量分數為86.93%，相對標準偏差(RSD)為4.2%(n=6)。按照實驗2.2 中粗多糖收率，得紅茶菌培養(yǎng)液中多糖含量為9.79 mg/100 mL。根據以上實驗結果，確定苯酚-硫酸法結合換算因子測定紅茶菌培養(yǎng)液中多糖方法可行。

3 討論

苯酚-硫酸法測定糖含量時，糖的種類對結果影響較大，且個別糖之間有較大差別，簡單以葡萄糖標準曲線對不同來源的多糖進行含量測定會使結果差異很大［10］，因此有必要采用換算因子法對測定結果進行校正，使測定結果更加接近真實值。本研究首次通過實驗計算發(fā)現紅茶菌多糖-葡萄糖的換算因子為5.93。

本實驗室對紅茶菌精制多糖進行了進一步分離，初步得到十一個多糖部位，對這些部位進行換算因子的測定，也有差異，表明這些多糖部位的單糖組成的不同，反映了換算因子校正測定結果只能盡可能接近真實值，應該針對具體的研究對象分別進行測定和計算，以保證實驗結果的可靠性。

近年來，對細菌及真菌來源的多糖逐漸清晰的藥理學研究，表明了其具有廣闊的開發(fā)應用前景，紅茶菌多糖部位中多糖含量測定結果的準確性，對紅茶菌多糖的進一步研究、開發(fā)和利用有現實意義，本文采用的方法操作簡便、顯色穩(wěn)定、重現性好、結果準確度高，可作為紅茶菌多糖的含量測定方法。

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