崔海燕，金 輝，王丹丹，路利芹，秦 波*

1中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室甘肅省天然藥物重點實驗室，蘭州 730000;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100039

松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus，PWN)引起的松樹萎蔫病被視為松樹的癌癥，其主要危害黑松、馬尾松、黃松、赤松、海岸松和黃山松等松屬植物，是一種毀滅性森林病害［1］。擬松材線蟲(Bursaphelenchus mucronatus)與松材線蟲的形態(tài)極為相似。關(guān)于擬松材線蟲的致病性，一直以來存在著爭議，分無致病性、弱致病性或潛在致病性以及強致病性的幾種觀點［2，3］。從近幾年來的研究結(jié)果來看，擬松材線蟲的致病性受環(huán)境條件的影響較大，在一定條件下也能造成大片松樹的死亡，而且擬松材線蟲往往比松材線蟲的分布范圍更廣，在同一地區(qū)常常是擬松材線蟲先出現(xiàn)，然后才有松材線蟲出現(xiàn)，例如在我國也在許多非松材線蟲病疫區(qū)的松樹尤其馬尾松上也發(fā)現(xiàn)了大量的擬松材線蟲。因此，在松材線蟲病的防治方面，擬松材線蟲理應(yīng)和松材線蟲一樣受到重視。

目前對于松材線蟲病的防治除了加強檢疫、林分改造和其它農(nóng)業(yè)措施之外，主要依賴化學(xué)防治。由于高毒殺線劑的使用，產(chǎn)生了環(huán)境污染和抗藥性等諸多問題。隨著人類環(huán)保意識的提高，生物防治已成為線蟲防治的主導(dǎo)。植物是天然活性物質(zhì)的重要寶庫，許多植物提取物對植物線蟲具有良好的殺線蟲活性［4］。研究和開發(fā)具有選擇性強、高效、低毒、環(huán)境友好、無公害的植物源線蟲觸殺活性物質(zhì)，利用植物活性代謝物防治松樹線蟲病，是保護森林資源和生態(tài)環(huán)境、促進我國林業(yè)發(fā)展的有效途徑。

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)為瑞香科狼毒屬植物，在我國東北、華北、西南、西北、內(nèi)蒙古和黑龍江等地廣泛分布［5］，其根中富含香豆素、雙黃酮和萜類等生物活性物質(zhì)［6］。據(jù)我國民間記載，其根粉常被用來作為殺蟲劑［7］，瑞香狼毒對山楂葉螨的毒力及酶活力影響和對蚜蟲的殺蟲活性已有報道［8，9］。但對瑞香狼毒根中二氫黃酮類成分的殺線蟲活性鮮有研究報道，只是以瑞香狼毒根部不同溶劑的萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性進行了報道，并沒有明確其具體的殺線蟲活性成分［10］。因此，本文就瑞香狼毒根乙醇提取物中分離鑒定的兩個二氫黃酮類化合物對松材線蟲和擬松材線蟲的觸殺活性進行了研究，以期為植物資源的開發(fā)利用和松樹線蟲病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物:植物材料于2009 年10 月采集于甘肅省定西市岷縣高山草甸，由蘭州大學(xué)生命科學(xué)院植物及植物生理研究所蒲訓(xùn)副教授鑒定為瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)的 根，植 物 標(biāo) 本(GSM002)保存于中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所天然藥物實驗室。

供試線蟲:松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)和擬松材線蟲(Bursaphelenchus mucronatus)，均分離自江蘇省溧水縣感病的馬尾松(Pinus massoniana)樹上，由南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院森林保護教研室的韓正敏教授鑒定并提供蟲源，然后在本實驗室自行擴繁。

1.2 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SW-CJ-2G(瑞士Buchi 公司)，循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康公司)，AL104 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，恒溫?fù)u床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)，HP250G-C 型智能光照培養(yǎng)箱(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)，LDZX-40 立式電熱壓力蒸汽滅菌(上海悅豐儀器儀表有限公司)，潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)。柱層析用硅膠(200～300 目)由青島海洋化工廠生產(chǎn)，薄層色譜用硅膠板GF254(0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠)。顯色劑為5%硫酸乙醇溶液，加熱顯色。1H 和13C NMR 譜在氘代溶劑(Acetone-d6)中用Varian Mercury-400BB 超導(dǎo)核磁共振儀測定，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)。高效氟氯氰菊酯，購自廣東瑞德豐生物技術(shù)有限公司。實驗中所用的試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 線蟲的培養(yǎng)

在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中加入約20 mL PDA固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，接入灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，于28 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，在培養(yǎng)基中央刻一小口，加入表面消毒過的線蟲約500 條。將培養(yǎng)皿用封口膜包好，正置放入28 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)。接種培養(yǎng)2～3 d 后將培養(yǎng)皿倒置，繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲消失，線蟲長滿平板。用無菌水將培養(yǎng)皿皿蓋上的線蟲懸浮，置于顯微鏡下，觀察濃度及蟲齡，準(zhǔn)確選取二齡幼蟲(簡稱J2)，供測試用。

1.3.2 瑞香狼毒根提取物中二氫黃酮類化合物的分離

將瑞香狼毒干燥根20 kg 進行粉碎，置于廣口瓶內(nèi)，95%乙醇中浸泡24 h，以滲漉法提取，滲漉液減壓濃縮，得乙醇提取物浸膏4.5 kg。然后將乙醇提取物浸膏用4 L 蒸餾水懸浮，依次分別用等體積的石油醚、氯仿和乙酸乙酯于室溫下連續(xù)萃取3 次，合并各萃取液，減壓濃縮，依次制得瑞香狼毒根的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水相萃取物浸膏，待試驗用。

將乙酸乙酯的萃取物浸膏1.46 kg 上硅膠柱(18 ×145 cm，3600 g)，用氯仿和甲醇(100∶0～100∶100)梯度依次洗脫，通過薄層色譜檢測，合并相近組分，得到14 個餾分(Fr1-14)，將其中的Fr8(135.2 g)經(jīng)硅膠柱(13 ×130 cm，900 g)層析，以氯仿和甲醇(40∶0～3∶1)梯度依次洗脫，通過薄層色譜檢測，合并相近組分，得到6 個組分(Fr8-1～8-6)，將其中的Fr8-4(92.5 g)再上硅膠柱(2 ×75 cm，160 g)，以氯仿和甲醇(20∶0～2∶1)梯度依次洗脫，得到兩個淡黃色粉末狀化合物1(79.4 mg)和化合物2(622.9 mg)。

1.3.3 觸殺活性測定

取線蟲懸浮液和二甲基亞砜(DMSO)溶解的樣品加到直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，樣品制成濃度為80 mmol/L 的母液，將上述母液于無菌濾膜過濾，分別稀釋至5、10、20 和40 mmol/L 四個濃度梯度。于24 孔板中每孔加入一定濃度的線蟲懸浮液495 μL，將實驗樣品的五個濃度梯度溶液各5 μL 依次加入24 孔板，使實驗樣品濃度占總濃度的1%，每個濃度重復(fù)兩次，以相同比例的DMSO 作為對照，在搖床上(180 rpm，2 min)混合均勻后，置于溫度為28 ℃、濕度為50%～60%的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每個處理選取3 個視野，重復(fù)兩次。處理后在40 倍顯微鏡下24、48、72 h 分別記錄各處理組線蟲的死亡情況，計算公式如下:

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 和SPSS 16.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以校正死亡率的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差()表示，同一時間點五個不同處理濃度的校正死亡率相互間的顯著性差異用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法(Duncan's Multiple Ranger Test，DMRT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 異新狼毒素A 和新狼毒素B 的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

瑞香狼毒根乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析，分別得到兩個淡黃色粉末狀固體化合物1(79.4 mg)和化合物2 (622.9 mg)，在254 nm 處有強吸收。以Acetone-d6為溶劑，結(jié)合1H 和13C NMR 數(shù)據(jù)對其結(jié)構(gòu)進行了分析鑒定。

化合物1 的1H NMR 中包含雙二氫黃酮的C2，C2″位的兩個質(zhì)子［δ 5.42(2H，s，J=0 Hz)］，C3，C3″位的兩個質(zhì)子［δ 3.37(2H，s，J=0 Hz)］信號，包含的12 個芳香質(zhì)子信號［δ 5.80～7.04］表明存在兩個典型的5，7-二氧取代的A 環(huán)［δ 5.80(2H，s，J=0 Hz)，5.93(2H，s，J=0 Hz)］和兩個典型的對位氧取代的B 環(huán)［δ 6.77(4H，d，J=8.0 Hz)，7.04(4H，d，J=8.0 Hz)］，同時化合物1 的13C NMR中顯示了兩個羰基碳(δc194.9，194.9)的信號，典型的5，7-二氧取代的A 環(huán)上6-，8-位的碳信號(δc96.4，95.3)和典型的對位氧取代的B 環(huán)上2-，3-，5-，6-位的碳信號(δc128.1，115.9，115.6，128.1)。C-2，C-2″(δc81.2，81.2)和C-3，C-3″(δc47.2，47.2)信號表明化合物1 是由兩個二氫黃酮單位組成的。通過與已知C-3/C-3″雙二氫黃酮的相應(yīng)質(zhì)子的J 值(0 和0 Hz)比較，化合物1 的C-2/C-3 和C-3″/C-2″位的相對構(gòu)型被確定為cis-cis。1H NMR 和13C NMR沒有甲氧基信號，提示化合物1 沒有甲氧基取代，結(jié)構(gòu)是高度對稱的?；衔? 的1H NMR 和13C NMR信號與異新浪毒素A 非常相似，通過與文獻對照［11］，故確定其為異新浪毒素A(isoneochamaejasmin A)。

化合物2 的1H NMR［δ 7.01(2H，d，J=8.4 Hz)］，［δ 7.08(2H，d，J=8.4 Hz)］，［δ 7.15 (2H，d，J=8.4 Hz)］，［δ 7.28(2H，d，J=8.4 Hz)］為兩個對位取代苯環(huán)的信號。比較化合物2 和化合物1 的1H NMR 和13C NMR，可以看出化合物2 與化合物1 的13C NMR 數(shù)據(jù)基本一致，但是在化合物2的1H NMR 數(shù)據(jù)中，C2，C2″位的兩個質(zhì)子［5.75(1H，d，J=4.4 Hz)，5.14(1H，d，J=8.4 Hz)］，C3，C3″位的兩個質(zhì)子［3.14(1H，s，J=0 Hz)，3.34(1H，d，J=3.2 Hz)］不同于化合物1 的C2，C2″位的兩個質(zhì)子和C3，C3″位的兩個質(zhì)子，說明二者的立體結(jié)構(gòu)不同，通過與已知C-3/C-3''雙二氫黃酮的相應(yīng)質(zhì)子的J 值比較，化合物2 的C-2/C-3 和C-3″/C-2″位的相對構(gòu)型被確定為cis-trans，化合物2 的1H NMR和13C NMR 信號與新狼毒素B 非常相似，通過與文獻對照［12］，故確定其為新狼毒素B(neochamaejasmin B)?；衔? 和化合物2 的結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 化合物1 和2 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1 and 2

異新狼毒素A 和新狼毒素B 的核磁波譜數(shù)據(jù)如下:

異新狼毒素A:1H NMR(Acetone-d6，400 MHz)δ:5.42(2H，s，H-2，H-2″)，3.37(2H，s，H-3，H-3″)，5.80(2H，s，H-6，H-6″)，5.93(2H，s，H-8，H-8″)，7.04(4H，d，J=8.0 Hz，H-2'，H-2″'，H-6'，H-6″')，6.77(4H，d，J=8.0 Hz，H-3'，H-3″'，H-5'，H-5″');13C NMR(Acetone-d6，100 MHz)δ:81.2(C-2，C-2″)，47.2(C-3，C-3″)，194.9(C-4，C-4″)，163.5(C-5，C-5″)，96.4(C-6，C-6″)，167.2(C-7，C-7″)，95.3(C-8，C-8″)，163.8(C-9，C-9″)，103.2(C-10，C-10″)，127.8(C-1'，C-1″')，128.1(C-2'，C-2″')，115.9(C-3'，C-3″')，157.7(C-4'，C-4″')，115.6(C-5'，C-5″')，128.1(C-6'，C-6″')。

新狼毒素B:1H NMR(Acetone-d6，400 MHz)δ:5.14(1H，d，J=8.4 Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J=4.4 Hz，H-2)，3.34(1H，d，J=3.2 Hz，H-3″)，3.14(1H，s，H-3)，5.96(1H，d，J=2.0 Hz，H-6″)，5.83(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.10(1H，d，J=2.0 Hz，H-8″)，5.98(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.15(2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，H-6')，7.28(2H，d，J=8.4 Hz，H-2″'，H-6″')，7.01(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，H-5')，7.08(2H，d，J=8.4 Hz，H-3″'，H-5″');13C NMR(Acetone-d6，100 MHz)δ:80.8(C-2)，82.8(C-2″)，49.0 (C-3)，49.8 (C-3″)，196.0 (C-4)，198.1(C-4″)，165.0(C-5)，165.3(C-5″)，97.0(C-6)，97.1(C-6″)，167.3(C-7)，167.7(C-7″)，96.0(C-8)，96.8(C-8″)，162.8(C-9)，164.7(C-9″)，103.7(C-10)，104.8(C-10″)，128.6(C-1')，129.9(C-1″')，128.5(C-2'，C-6')，130.6(C-2″'，C-6″')，116.3(C-3'，C-5')，116.4(C-3″'，C-5″')，158.3(C-4')，158.6(C-4″')。

2.2 異新狼毒素A 和新狼毒素B 對松材線蟲的室內(nèi)觸殺活性測定結(jié)果

分別精確稱取異新狼毒素A 和新狼毒素B 減壓干燥樣品溶于DMSO 中制成樣品為80 mmol/L 的母液。試驗時以適量DMSO 將母液依次稀釋成濃度分別為5、10、20 和40 mmol/L 四個濃度梯度的試液，對松材線蟲進行室內(nèi)生物活性測定。試驗中設(shè)與試驗藥液相應(yīng)濃度的DMSO 作為對照，異新狼毒素A 和新狼毒素B 對松材線蟲的室內(nèi)觸殺活性試驗結(jié)果見表1。處理24 h 后，800 μmol/L 濃度下異新狼毒素A 和新狼毒素B 對松材線蟲的觸殺活性分別為10.98%和31.22%，此濃度下二者對松材線蟲的觸殺活性與50 μmol/L 濃度下相比差異極顯著(P ＜0.01)。隨著處理時間和濃度的增加，兩個化合物對松材線蟲的觸殺活性逐漸增強。處理72 h后，800 μmol/L 濃度下異新狼毒素A 和新狼毒素B對松材線蟲的觸殺活性分別為47.13%和54.32%，此濃度下二者對松材線蟲的觸殺活性與50 μmol/L濃度下相比差異極顯著(P ＜0.01)。

表1 瑞香狼毒根中活性物質(zhì)對松材線蟲的觸殺活性影響Table 1 Effects of two isolated compounds from the roots of S.chamaejasme on the mortality of B.xylophilus

2.3 異新狼毒素A 和新狼毒素B 對擬松材線蟲的室內(nèi)觸殺活性測定結(jié)果

試驗方法同2.2，然后對擬松材線蟲進行室內(nèi)生物活性測定。異新狼毒素A 和新狼毒素B 對擬松材線蟲的室內(nèi)觸殺活性試驗結(jié)果見表2。處理24 h 后，800 μmol/L 濃度下異新狼毒素A 和新狼毒素B 對擬松材線蟲的觸殺活性分別為9.00% 和18.08%，此濃度下異新狼毒素A 對擬松材線蟲的觸殺活性與其他濃度下相比差異不顯著，而新狼毒素B 在800 μmol/L 濃度下對擬松材線蟲的觸殺活性與50、100 和200 μmol/L 濃度下相比差異極顯著(P ＜0.01)。隨著處理時間和濃度的增加，兩個化合物對擬松材線蟲的觸殺活性逐漸增強。處理72 h后，在最大濃度下異新狼毒素A 和新狼毒素B 對擬松材線蟲的觸殺活性分別達到了49.00% 和65.24%。

表2 瑞香狼毒根中活性物質(zhì)對擬松材線蟲的觸殺活性影響Table 2 Effects of two isolated compounds from the roots of S.chamaejasme on the mortality of B.mucronatus

2.4 異新狼毒素A 和新狼毒素B 對松材線蟲和擬松材線蟲的觸殺活性測定結(jié)果比較

異新狼毒素A 和新狼毒素B 對松材線蟲和擬松材線蟲的觸殺活性試驗比較結(jié)果見表3。

處理24 h 后，異新狼毒素A 對松材線蟲和擬松材線蟲的LC50值分別為39.15 和599.90 mmol/L，新狼毒素B 對松材線蟲和擬松材線蟲的LC50值分別為6.57 和12.49 mmol/L，處理72 h 后，異新狼毒素A 對松材線蟲和擬松材線蟲的LC50值分別為0.71 和0.76 mmol/L，新狼毒素B 對松材線蟲和擬松材線蟲的LC50值分別為0.48 和0.20 mmol/L，從表3 可以看出，在相同的處理時間下，新狼毒素B對兩種線蟲的觸殺活性均強于異新狼毒素A 對二者的觸殺活性。

表3 瑞香狼毒根中活性物質(zhì)對松材線蟲和擬松材線蟲的觸殺活性影響Table 3 Nematicidal effect of the active compounds from the roots of S.chamaejasme on J2 of B.xylophilus and B.mucronatus

注:aND:未檢測到;b陽性對照。Note:aND:Not detected;b Positive control.

3 討論

通過對瑞香狼毒根乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位進行分離鑒定，得到了兩個二氫黃酮類化合物，異新狼毒素A 和新狼毒素B，并研究了這兩個二氫黃酮類化合物對林業(yè)上危害嚴(yán)重的松材線蟲和與松材線蟲形態(tài)相似的擬松材線蟲的觸殺活性。結(jié)果表明，兩個二氫黃酮類化合物對松材線蟲和擬松材線蟲均顯示出一定的觸殺活性，且在相同的處理時間和濃度下，新狼毒素B 對兩種線蟲的觸殺活性均強于異新狼毒素A。兩個二氫黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)差別僅在于新狼毒素B 的相對構(gòu)型是cis-trans，而異新狼毒素A 的相對構(gòu)型則為cis-cis，說明兩種化合物的活性差異可能與其立體構(gòu)型有關(guān)。

瑞香狼毒是草原上廣泛分布的一種毒草，與化學(xué)農(nóng)藥相比，它具有很多的優(yōu)勢如高效、低毒、無污染且對環(huán)境友好，如將其開發(fā)成植物源殺線蟲劑具有一定的意義。再者將其變廢為寶同時對于草原生態(tài)的建設(shè)也有一定的影響。本研究通過對瑞香狼毒根中活性物質(zhì)的研究，為植物源殺線蟲劑的開發(fā)提供了先導(dǎo)化合物，對我國林業(yè)線蟲病的防治具有重要的意義。

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