董麗輝，范三微，凌慶枝*，錢(qián)海峰，魏兆軍

1浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，寧波 315100;2 合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，合肥 230009

石杉?jí)A甲(Huperzine A)分離自我國(guó)傳統(tǒng)中藥千層塔，其商品名為哈伯因，化學(xué)名為(5R，9R，11E)5-氨基-11-亞乙基-5，6，9，10-四氫-7-甲基-5，9-亞甲環(huán)芳辛并-2(1H)吡啶酮。藥理學(xué)研究表明石杉?jí)A甲是一種高選擇性抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的藥物，能夠改善多種認(rèn)知功能缺陷，治療重癥肌無(wú)力和早中期老性癡呆癥(Alzheimer's disease，簡(jiǎn)稱AD)具有顯著療效。目前國(guó)際上已將石杉?jí)A甲列為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑之一，1995 年石杉?jí)A甲制劑在國(guó)內(nèi)上市應(yīng)用［1］。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，對(duì)治療老年癡呆癥的藥物的需求量會(huì)越來(lái)越大，石杉?jí)A甲僅依靠千層塔植物的提取遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)的需求，石杉?jí)A甲來(lái)源問(wèn)題已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

內(nèi)生菌是指那些在其生活史中的某一階段生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的菌。研究證實(shí)，生活在植物體的內(nèi)生真菌與宿主植物具有相同的次生代謝產(chǎn)物的合成途徑，能產(chǎn)生與宿主相同或相似的，具有生理活性的代謝產(chǎn)物。自1993 年發(fā)現(xiàn)從短葉紅豆杉中分離出的內(nèi)生真菌能夠合成抗癌成分紫杉醇以來(lái)［2］，人們希望通過(guò)尋找合適的內(nèi)生真菌并使其發(fā)酵合成藥用成分，內(nèi)生真菌有可能成為開(kāi)發(fā)新型藥效活性物質(zhì)的重要生物資源。前期的研究證實(shí)，千層塔植物中蘊(yùn)含大量的內(nèi)生真菌，這給篩選產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)生真菌提供了天然的資源。

本試驗(yàn)從千層塔中分離到了不少有價(jià)值的內(nèi)生真菌，在此基礎(chǔ)上對(duì)內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制和清除DPPH·自由基能力的試驗(yàn)，對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物進(jìn)行TLC 和HPLC 檢測(cè)，以便進(jìn)一步篩選產(chǎn)石杉?jí)A甲的菌株。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料千層塔Huperzia serrata (Thunb.)Trev.采自浙江杭州天目山脈。

1.2 儀器與試劑

TLC 板(GF254):煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司;DIONEX-3000 高效液相色譜儀;電泳儀及電泳槽:美國(guó)Bio-Rad 公司;PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀:加拿大BBI 公司;3730 測(cè)序列分析儀:美國(guó)ABI 公司;多功能酶標(biāo)儀:美國(guó)熱電公司。

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)、二苯代苦味?；鵇PPH 標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自Sigma 石杉?jí)A甲(Huperzine A，HupA)標(biāo)品:中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;色譜純甲醇:天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3'):由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。醋酸銨及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生物試劑。

1.3 方法

1.3.1 千層塔內(nèi)生真菌的分離及發(fā)酵產(chǎn)物制備

選用新鮮藥用植物千層塔，洗凈后，流水沖洗4 h。在超凈工作臺(tái)上 按莖、葉、根分開(kāi)。莖用0.1%升汞溶液消毒15 min。葉片和根在0.1%升汞溶液中浸泡10 min。取出材料，無(wú)菌水沖洗6 遍。在無(wú)菌條件下，將根莖葉分別切成0.5 cm 的長(zhǎng)度接種于MS 培養(yǎng)基上。28 ℃培養(yǎng)40 d，將最后一次蕩洗的水涂布在平板上作對(duì)照。培養(yǎng)7 d 以后，對(duì)照板上并沒(méi)有菌生長(zhǎng)，而千層塔的切口處有菌絲長(zhǎng)出，用接種環(huán)將菌絲接種到新的PDA 培養(yǎng)基上，平板劃線分離，得到純的菌株。

采用馬鈴薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)生真菌，28 ℃，120 rpm，培養(yǎng)10 d，收集菌絲，破碎細(xì)胞，用熱乙醇回流提取有效成分，濃縮提取液到1 mL。發(fā)酵液濃縮后用乙醇醇沉，除多糖，蛋白，濃縮到1 mL。保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物AChE 抑制活性檢測(cè)

方法參照［3］的方法，在試管中加入內(nèi)生真菌的菌絲或發(fā)酵液提物樣品20 μL、在15 μL 0.22 U/mL AChE、15 μL 15 mmol/L ATCI，加磷酸緩沖液50 μL，搖勻37 ℃恒溫30 min，加10 μL 4%十二烷基硫酸鈉，室溫下終止反應(yīng)20 min，移入96 孔板上，加顯色劑125 μL 3 mmol/L，DTNB 顯色5 min，412 nm處酶標(biāo)儀檢測(cè)，設(shè)為A樣品，每個(gè)樣品都設(shè)一個(gè)不加底物，反應(yīng)條件和樣品一樣，測(cè)得值設(shè)為A本底，陰性對(duì)照用磷酸緩沖液代替樣品，反應(yīng)條件與樣品一致，測(cè)定值設(shè)為A陰性，陽(yáng)性對(duì)照不加底物，其它條件與陰性對(duì)照一致，測(cè)定值設(shè)為A陽(yáng)性，以下列公式計(jì)算內(nèi)生真菌對(duì)AChE 的抑制率(I):

1.3.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物清除DPPH·自由基能力的測(cè)定［4］

取發(fā)酵液或菌絲體提取物樣品1 mL，加入2.4 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，混勻，加水0.6 mL，室溫靜置暗反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm 處的吸光度為A1。對(duì)照品用樣品溶劑替代，測(cè)得的吸光度為A2，未反應(yīng)時(shí)DPPH 的值吸光度為A0。

1.3.4 TLC 檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物

用2 cm×10 cm 的硅膠板，展開(kāi)劑為:氯仿/丙酮/異丙醇(4∶6∶4)，顯色劑:0.3%高錳酸鉀溶液，用毛細(xì)管直接將0.4 μL 樣品和石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在距薄層板一端約1 cm 處，點(diǎn)完干燥后將板置于展開(kāi)液中，待展開(kāi)到離板另一端約1 cm 處取出層析板，自然干燥。待溶劑基本揮發(fā)后，用噴霧器噴上顯色劑，吹干，記錄斑點(diǎn)，測(cè)Rf值。

1.3.5 HPLC 檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物

采用DIONEX-3000 色譜系統(tǒng)，ODS-C18反相柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，色譜條件為:流動(dòng)相為甲醇:0.1 moL/L 醋酸銨(pH 6.0)(36∶64);流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)308 nm。稱取石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品12.75 mg，于25 mL 的容量瓶中用流動(dòng)相溶解置刻度。吸取石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中稀釋到刻度，樣品用流動(dòng)相稀釋成5 mL 的溶液，膜過(guò)濾備用，根據(jù)石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間對(duì)樣品定性，以峰面積與對(duì)應(yīng)濃度繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中石杉?jí)A甲的含量。

1.3.6 產(chǎn)石杉?jí)A甲菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將內(nèi)生真菌菌株接種于PDA 或查氏培養(yǎng)基上，對(duì)真菌菌落的形態(tài)特征進(jìn)行觀察，將滅菌的濾紙于無(wú)菌水中濕潤(rùn)，置于培養(yǎng)皿中，放上滅菌載玻片上，在載玻片上滴上一滴PDA 培養(yǎng)基，將真菌接種到培養(yǎng)基上，蓋上蓋玻片培養(yǎng)，培養(yǎng)后對(duì)菌株的菌絲、孢子囊等微觀形態(tài)進(jìn)行觀察記錄。最后，比照《真菌鑒定手冊(cè)》［5］，鑒定所分離的內(nèi)生真菌的種屬。

1.3.7 菌株的分子鑒定

將培養(yǎng)在PDA 上的內(nèi)生真菌菌絲刮下，置于試管中，加500 μL CTAB 提取緩沖液，玻棒研磨，65 ℃保溫1 h，12000 rpm 離心10 min，取上清，飽和酚和氯仿異戊醇分別抽提后，用無(wú)水乙醇沉淀，12000 rpm 離心，倒出乙醇溶液，沉淀晾干后，溶于50 μL純水中備用。

PCR 擴(kuò)增菌株ITS 區(qū)段:根據(jù)已知真菌的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3')，以真菌基因組DNA 為模板，擴(kuò)增菌株ITS區(qū)段。PCR 反應(yīng)體系為:PCR 體系建立(25 μL):TempLate(基因組)1 μL，引物各(10 μmoL/L)0.5 μL，dNTP(各10 mmoL/L)0.5 μL，10 ×PCR Buffer 2.5 μL，Taq(5 U/μL)0.2 μL 加水至25 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃5 min;循環(huán)94 ℃30 s，55 ℃35 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，延伸8 min。PCR 產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，序列提交到GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)并得到登錄號(hào)。應(yīng)用Blast 程序?qū)λ鶞y(cè)得的內(nèi)生真菌ITS 序列進(jìn)行相似性比對(duì)。采用軟件ClustaLX 1.81 進(jìn)行多序列的比較，比對(duì)結(jié)果采用DNAStar MegAlign 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 千層塔內(nèi)生真菌的分離

從千層塔植物中分離到94 株內(nèi)生真菌，對(duì)照培養(yǎng)基上并無(wú)菌生長(zhǎng)，可以確定分離到的94 株為內(nèi)生真菌，結(jié)果如表1 所示其中莖中所含內(nèi)生真菌最多，為49 株，占總菌株數(shù)的52.12%;其次為葉片38株，占40.42%，根內(nèi)最少，僅7 株，占7.44%。將內(nèi)生真菌通過(guò)形態(tài)觀察分類可以將菌株歸到Penicillium、Cladosporium、Colletotrichum、Acremonium、Mortierella、Paraconiothyrium、Leptosphaeria、Shiraia、Arthrinium、Podospora 等12 個(gè)屬，其中Penicillium、Colletotrichum、Podospora 為優(yōu)勢(shì)類群。

表1 千層塔不同組織中分離到的內(nèi)生菌Table 1 Isolation of endophytic fungi from different parts of H.serrate

2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物抑制乙酰膽堿酯酶和清除DPPH·自由基能力檢測(cè)結(jié)果

將內(nèi)生真菌發(fā)酵菌絲和發(fā)酵液提取物分別做抑制乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)和清除DPPH·自由基能力檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。菌S29、S94、L44 這三株內(nèi)生真菌有明顯活性。從表1 可見(jiàn)，菌絲體提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性比發(fā)酵液提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性高，而菌絲體提取物和發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率比較接近。

表2 內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制率和DPPH·自由基清除率Table 2 DPPH· scavenging and AchE inhibitory activities of mycelium and fermentation broth of endophytic fungi

2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物TLC 檢測(cè)結(jié)果

將內(nèi)生真菌的菌絲提取物和發(fā)酵液提取物和石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣層析，結(jié)果(圖1)顯示，S29 菌絲提取物中有石杉?jí)A甲或其類似物，遷移率與石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品接近，石杉?jí)A甲和S29 菌絲提取物的遷移率分別為0.707、0.699，其他內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物并未發(fā)現(xiàn)有遷移率與石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品非常接近。

圖1 千層塔內(nèi)生真菌S29(A)及石杉?jí)A甲(B)的TLC 色譜圖Fig.1 TLC analysis results of HupA standard (A)and endophytic fungus S29 from H.serrate (B)

2.4 菌株S29 發(fā)酵提取物HPLC 測(cè)定結(jié)果

石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)高效液相色譜檢測(cè)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品都在保留時(shí)間5.97 min 有強(qiáng)的吸收峰(圖2A，C標(biāo)準(zhǔn)品=51 μg/mL，峰面積=27.152)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與對(duì)應(yīng)濃度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為:y=0.531x +0.2637，r2=0.9996，石杉?jí)A甲在5.1～51 μg/mL 有良好的線性關(guān)系。菌株S29 的菌絲體提取物在保留時(shí)間5.940 min，有相似的吸收峰(圖2B，峰面積=6.168)并與其他雜質(zhì)成良好的分離，S29 的發(fā)酵液體取物種并沒(méi)有類似的吸收峰，故推測(cè)S29 是產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌，并且石杉?jí)A甲在菌絲體中，應(yīng)為胞內(nèi)產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出S29 樣品中石杉?jí)A甲含量為11.12 μg/mL，共為5 mL，樣品中石杉?jí)A甲量為55.60 μg，菌絲體的重量為1.098 g，故每克干菌體的石杉?jí)A甲的含量50.64 μg。

圖2 石杉?jí)A甲(A)及內(nèi)生真菌S29 菌絲體(B)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of HupA stardand (A)and strain S29 (B)

2.5 產(chǎn)石杉?jí)A甲菌株S29 鑒定

產(chǎn)石杉?jí)A甲菌株S29 接種于PDA 培養(yǎng)基中間28 ℃，培養(yǎng)6 d 菌落直徑為50 mm，培養(yǎng)到13～14 d可以鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，菌落在生長(zhǎng)4～6 d 顏色為黑色，略顯棕色，邊緣一圈為淡黃色，生長(zhǎng)至整個(gè)平皿時(shí)邊緣為黑色，菌落中間為棕色，質(zhì)地為絨狀，菌落中間有細(xì)小的顆粒狀，在PDA 培養(yǎng)基上反面為黑色，菌落邊緣一圈略先淡黃色，在查氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～5 d，菌落的直徑為45～50 mm，10 d 可以鋪滿整個(gè)平皿，在麥麩培養(yǎng)基上菌落易擴(kuò)展，氣生菌絲較松散，橄欖綠色，無(wú)可溶性色素;在顯微鏡下觀察，菌絲有橫隔，顯微特征:玉米粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，可見(jiàn)子囊果生長(zhǎng)。菌絲發(fā)達(dá)，有隔，褐色，子囊果發(fā)育在菌絲層上，為球形無(wú)孔閉囊殼，單獨(dú)、表生，球形，直徑130～220 μm，無(wú)孔口;厚壁，棕褐色，子囊棍棒狀;子囊孢子深褐色，園形，厚壁，無(wú)芽孔(圖3)。

圖3 菌株S29 菌落及顯微特征Fig.3 Colony and microscopic characteristics of strain S29

2.6 菌株S29 的ITS 序列及發(fā)育分析

以ITS1 和ITS4 為引物，在菌株S29 基因組DNA 中擴(kuò)增出一條516bp 的序列，在GenBank 登入獲得登入號(hào)(KC411775)。所得序列經(jīng)BLAST 分析，結(jié)果表明該序列與1 株P(guān)odospora sp.XSD-39(序列EU273519.1)同源性達(dá)100%。在以DNAStar MegAlign 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，菌株S29 與Podospora sp.屬的進(jìn)化距離也最近(圖4)。

圖4 菌株S29 基于ITS-rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育和序列距離分析Fig.4 Phylogenetic and sequence distances analysis of strain S29 based on ITS-rDNA sequences

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從94 株內(nèi)生真菌中篩選出3 株有顯著的抑制乙酰膽堿酯酶活性和清除DPPH·自由基能力的內(nèi)生真菌。對(duì)內(nèi)生真菌的發(fā)酵提取物進(jìn)行TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株S29 的遷移率與石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品接近，對(duì)菌株的發(fā)酵提取物進(jìn)行HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株S29 菌絲體提取物保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品非常相近，可以確定，菌株S29 的菌絲體中含有石杉?jí)A甲，對(duì)菌株S29 進(jìn)行經(jīng)形態(tài)學(xué)和rDNA ITS 序列分析，判定此菌分類地位:子囊菌亞門(mén)(Mastigomycotina)核菌綱(Pyrenomycetes)球殼目(Sphaeriales)毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)柄孢殼菌屬(Podospora)。Podospora sp.屬的植物分布非常廣泛，孫若瓊等［6］從12 株蛇足石杉中分離到一株可能產(chǎn)生石杉?jí)A甲或其類似物的菌株190 號(hào)，對(duì)該菌株進(jìn)行分子鑒定，該菌株為Podospora sp 屬，可見(jiàn)該屬的菌有產(chǎn)石杉?jí)A甲的潛力。包麗霞等［7］從北細(xì)辛中分離到10 株菌，其中一株為Podospora sp.屬的菌株，該菌株具有抗腫瘤的活性?？梢?jiàn)Podospora sp.屬真菌在植物中分布廣泛，它們的次級(jí)代謝產(chǎn)物非常豐富。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者在千層塔內(nèi)生真菌的分離到了產(chǎn)石杉?jí)A甲的菌株數(shù)株，對(duì)其產(chǎn)量進(jìn)行了測(cè)定。黎萬(wàn)奎等［8］，從蛇足石杉中分離到的Acremonium sp.2F09P03B，產(chǎn)量為8.32 μg/mL，鞠鏨等［9］通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)條件，從柳杉葉馬尾杉(Phlegmariurus crytomerianus)中分離出能產(chǎn)生石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌Blastomyces sp.HA15 和Botrytis sp.HA23，產(chǎn)石杉?jí)A甲的產(chǎn)量為每克干菌絲20～30 μg。Zhu［10］等從蛇足石杉中分離到能產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生菌SLF14，其產(chǎn)量為每克干菌絲石杉?jí)A甲含量為142.6 μg?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，從石杉科植物中也篩選出能產(chǎn)生石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌，這為石杉?jí)A甲臨床應(yīng)用提供了新的來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株產(chǎn)石杉?jí)A甲量還較低，難以產(chǎn)業(yè)化，因此對(duì)菌株進(jìn)行改良，使石杉?jí)A甲在宿主體內(nèi)高效表達(dá)是未來(lái)研究的方向。

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