李 范，李 娜，陳建中，蔣小強，陳 怡，李 萍

1西南交通大學，成都 610031;2 中國科學院成都生物研究所，成都 610041

磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids，PLFAs)是活體生物細胞膜磷脂的重要成分，周轉(zhuǎn)速率極快且隨細胞死亡而迅速降解［1］，脂肪酸結構與種類多樣，對環(huán)境因素敏感，分析結果重復性較好［2］。既可用簡單試劑和設備測定由PLFAs 轉(zhuǎn)化的磷酸鹽以確定微生物總量，也可以根據(jù)不同菌群的特定脂肪酸C 鏈長度、飽和度及羥基等取代基位置差異研究特殊功能菌群［1］。PLFAs 的穩(wěn)定同位素分析聯(lián)用技術可用于研究復雜土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物源有機質(zhì)的代謝途徑，并識別特定微生物種群特征，可將個別微生物種群與其相應的生物化學過程聯(lián)系起來。因此，PLFAs 在土壤微生物學研究中極具潛力，PLFAs 技術已被用于細菌純培養(yǎng)對外界脅迫的應答、根系排泄物對根際微生物影響、養(yǎng)分對泡囊叢枝菌的影響、農(nóng)田土壤微生物區(qū)系特征以及誘導植物抗病性等領域［3］;高寒濕地土壤微生物群落結構分析、重金屬/有機物污染土壤植物修復、微生物對有毒底物降解過程、外加碳源利用等研究［4］。

脂肪酸分析方法在很大程度上依賴于標記脂肪酸來確定土壤微生物群落結構，因而標記上的變動，將導致群落估算上的偏差。如果脂肪酸的提取不完全，就會造成一些重要的信息丟失，所以應運用更好的實驗方法盡可能地提取脂肪酸。已報道文獻中，大部分用于提取土壤中脂質(zhì)的方法是建立在Bligh和Dyer［5］的操作守則上的。根據(jù)這個操作方法所提取的總脂類，只能用于表征土壤總的微生物生物量。Tunlid 等［6］進一步發(fā)展了這個方法，通過提取和分離磷脂脂肪酸來確定土壤微生物的群落結構。此后，研究方法不斷完善，但不同研究者選用的方法或多或少會有一些差異，如提取劑種類及使用量的不同、土樣量以及提取時間的不同等。然而，只有少數(shù)的研究比較了不同提取方法對實驗結果的影響。例如，Nielsen 和Pertersen［7］比較了提取劑(氯仿或二氯甲烷)、甲醇和緩沖液(pH7.4 的磷酸鉀或pH4.0 的檸檬酸鈉)四種不同組合方式對PLFAs 提取效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，氯仿+檸檬酸鹽緩沖液對PLFA 的提取效率最高，而二氯甲烷+磷酸鹽緩沖液的提取效率最低;同時指出，提取磷脂的顏色一般由黃色至棕色，它們主要是由腐殖酸引起的(占PLFAs 總量5%～10%)。Frosteg?rd 等［8］評價了消化時間、消化方法、儲存條件和提取液種類對土壤總脂類磷酸鹽提取的影響。然而，總脂類磷酸鹽分析與PLFAs 分析之間存在著很大的差異。目前尚未見采用響應面法超聲輔助提取磷脂脂肪酸的報道，為此，本文以森林土為試驗材料，通過對土壤PLFAs 提取過程中超聲溫度、超聲時間及提取劑用量等因素的研究，使用響應面法［9］優(yōu)化提取工藝，為PLFAs 技術分析復雜土壤微生物提供更精確的科學依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野外取樣點位于四川省阿壩州茂縣鳳儀鎮(zhèn)靜州村大溝的中國科學院成都生物研究所茂縣山地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站(103°53'E，31°41'N)，該區(qū)域地處青藏高原東緣橫斷山系北段高山峽谷地帶的長江重要支流岷江上游中部，屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨。研究土壤為棕壤，植被類型為次生灌叢。年均溫為8.9 ℃，年均降水量為919.5 mm。取土壤表層以下0～20 cm 處土壤，隨機選擇4 個點取土后混合作為一個土樣，過2 mm篩，去掉石塊、植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃下冷凍保存。正己烷、正十九烷酸甲酯(色譜純，Sigma)，C9-C20 脂肪酸混合標準品(批號112280，MIDI)，甲醇、甲苯、氯仿、丙酮、乙酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱為Agilent 19091B-102E(25 m ×0.2 mm×0.33 μm)石英毛細管柱;進樣口溫度250 ℃，進樣口壓力9.77 Psi，柱溫箱溫度170 ℃，汽化室溫度250 ℃，檢測器溫度300 ℃。二階程序升高柱溫:170 ℃起始，5 ℃/min 室溫升至260 ℃，而后40 ℃/min 升溫至310 ℃，維持90 s;恒壓模式，尾吹氣N2(30 mL/min);進樣量2 μL，進樣分流比100∶1。

1.3.2 超聲提取

稱取8.0 g 凍干土(過2 mm 篩)置于特氟隆離心管中，加入21 mL 提取劑(氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液比為1∶2∶0.8)。在20 ℃下超聲提取30 min，7200 rpm 離心5 min，收集上清液。原離心管中再加入21 mL 提取液，再次超聲15 min，離心，合并上清液［5，6］。加入10 mL 檸檬酸緩沖液和10 mL 氯仿，靜置過夜，分層。移去上層液體，37 ℃水浴N2吹干。采用購買的商品SPE 柱(天津艾杰爾公司)，首先用5 mL 氯仿活化柱子，然后用1 mL 甲醇轉(zhuǎn)移脂類到SPE 柱中。再分別加入5 mL 氯仿和10 mL 丙酮洗去中性脂和醣脂，最后用5 mL 甲醇淋洗磷脂，收集淋洗液并N2吹干。依次加入1 mL 甲醇甲苯混合液(1∶1)和1 mL KOH 甲醇溶液(0.2 mol/L)，于37 ℃水浴15 min，加入2 mL 水、0.3 mL 醋酸(1 mol/L)，再用正己烷(兩次，2 mL/次)萃取磷脂脂肪酸甲酯，并N2吹干。樣品溶解于100 μL 正十九烷酸甲酯(25 mg/L，溶劑為正己烷)，轉(zhuǎn)移到色譜瓶，上機檢測。

1.3.3 PLFAs 含量標定與計算

PLFAs 含量標定與計算，以正十九烷酸甲酯(C19∶0)為內(nèi)標，利用相關因子系數(shù)進行校正，計算土壤中的相應磷脂脂肪酸的濃度。

式中，ax為該磷脂脂肪酸甲酯在GC 圖譜上的響應值(即積分面積);mi為內(nèi)標磷脂脂肪酸甲酯的含量(單位:nmol/g);ai為內(nèi)標磷脂脂肪酸甲酯在GC 圖譜上的響應值。

所有試驗重復3 次，以出現(xiàn)2 次以上的單體PLFAs 的濃度加和，計算總PLFAs 濃度(單位:nmol/g)，視為衡量PLFAs 提取效率的參數(shù)。

1.3.4 單因素實驗

主要考察超聲溫度、超聲時間、提取劑用量等因素對森林土PLFAs 提取效率的影響;本實驗超聲溫度選取10、15、20、25、30 ℃五個水平;超聲時間選擇10、20、30、40、60 min 五個水平;提取劑用量選擇17、19、21、23、25 mL/8 g 樣品。按單因素分析方法進行實驗。

1.3.5 響應面法優(yōu)化PLFAs 提取條件

根據(jù)單因素實驗結果，以超聲溫度(A)、超聲時間(B)、提取劑用量(C)三個因素，以總PLFAs 提取率為響應值，選擇Box-Behnken Design 響應面法優(yōu)化分析方法進行設計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度對PLFAs 提取效率的影響

固定超聲時間30 min，提取劑用量21 mL/8 g，選擇超聲溫度分別為10、15、20、25、30 ℃，按照

1.3.2 進行實驗。結果見圖1(A)。

由圖1 可見，總PLFAs 的含量隨著溫度的升高而提高，但是在25 ℃出現(xiàn)下降。溫度的升高可促進溶液中分子的運動，有利于提高提取率，但由于大部分脂肪酸在20 ℃以下是穩(wěn)定的，部分脂肪酸在超過25 ℃時易揮發(fā)，造成總PLFAs 含量降低，故選擇超聲溫度為20 ℃。

2.1.2 提取時間對PLFAs 提取效率的影響

在超聲溫度20 ℃，提取劑用量21 mL/8 g，分別用不同的超聲時間按照1.3.2 對森林土進行提取。提取時間對PLFAs 含量的影響如圖1(B)所示。由圖可知，隨著超聲作用時間的增加，森林土總PLFAs含量增加。但是超過40 min 后，總PLFAs 濃度有所下降，這可能是由于超聲造成溶液溫度的升高。據(jù)測量，超聲時間每增加10 min，溶液溫度上升3 ℃，超聲時間越長溫度上升越高，隨著溫度的上升，造成脂肪酸中不穩(wěn)定的部分揮發(fā)損失。因此，選擇提取時間30 min 左右較為合適。

2.1.3 提取劑用量對PLFAs 提取效率的影響

在超聲溫度20 ℃，提取時間30 min，森林土8 g，分別用17、19、21、23、25 mL 提取劑按照1.3.2 進行提取。提取劑用量對PLFAs 含量的影響如圖1(C)所示。由圖可知，隨著超聲作用時間的增加，總PLFAs含量上升;但當提取劑用量超過21 mL 后，總PLFAs 含量變化不明顯，而且成本增加，不利于應用于大批量生態(tài)環(huán)境樣品的處理，因此最佳提取劑用量為21 mL。

圖1 超聲溫度(A)、提取時間(B)及提取劑用量(C)對總PLFAs 得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature (A)，extraction time (B)and amount of extraction solvent (C)on extraction yield of total PLFAs

2.2 響應面分析實驗結果與數(shù)據(jù)分析

表1 響應面因素水平選取表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

根據(jù)Box-Behnken Design 的原理，選取超聲溫度、超聲時間、提取劑用量作為對森林土總PLFAs含量影響的主要因素，采用三因素三水平的響應曲面分析方法進行試驗設計，試驗自變量因素編碼及水平見表1。

利用Design Expert 8.0 軟件，通過表2 中總PLFAs 含量實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，對實驗結果進行響應面分析，得出回歸模型方差分析表和響應曲線面圖，分別見表3 和圖2。

表2 Box-Behnken 中心組合設計方案及實驗結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

圖2 各兩因素交互作用對總PLFAs 提取效率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of total PLFAs

由方差分析結果可知:模型的F=31.66，P ＜0.0001，說明本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性。F失擬=3.52，失擬項P=0.1277 ＞0.05，失擬不顯著。模型的決定系數(shù)R2Adj=0.9452，說明該模型能夠解釋94.52%的響應值變化。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預測超聲波輔助提取森林土中總PLFAs 的工藝條件。在總的作用因素中，回歸方程一次項、二次項及交互項AC、BC 均具有較高的顯著性，表明超聲溫度、超聲時間、提取劑用量以及超聲溫度與提取劑用量、超聲時間與提取劑用量的交互作用對森林土中總PLFAs 得率有較顯著影響。

通過擬合可求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到森林土總PLFAs 提取效率Y 與各因素變量(A 超聲溫度，B 超聲時間，C 提取劑用量)的二次方程模型為:

Y=46.33-0.25A +0.47B +0.88C +0.58AB +1.29AC+1.12BC-2.51A2-1.24B2-1.82C2

從表3 中方差分析結果可知方程一次項、二次項的影響均極顯著，說明分析結果可靠;從試驗所得的響應面分析結果可以找到它們在提取過程中的交互作用，如表3 和圖2 可知超聲溫度與提取劑用量、超聲時間與提取劑用量之間的交互作用顯著，其余項間的交互作用不明顯。根據(jù)Design Expert 8.0 軟件對實驗結果進行最優(yōu)化分析，確定最佳的提取條件為:超聲溫度20.47 ℃，超聲時間33.78 min，提取劑用量21.78 mL，在此條件下，預測提取總PLFAs濃度為46.5774 nmol/g。

2.3 驗證實驗

為了驗證上述模型的可信度與合理性，根據(jù)模型預測結果進行近似驗證實驗。取8 g 森林土在溫度20 ℃，提取時間30 min，提取劑用量21 mL 條件下，提取總PLFAs 濃度為45.57 nmol/g (n=3，單體PLFAs 個數(shù)35 個)。

3 討論

用超聲輔助法提取森林土中總PLFAs，根據(jù)單因素實驗結果，采用Box-Behnken 試驗設計及響應面分析對提取工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取條件為:超聲溫度20 ℃，超聲時間30 min，提取劑用量21 mL/8 g 土壤樣品。在此條件下，總PLFAs 濃度為45.57 nmol/g(n=3，單體PLFAs 個數(shù)35 個)。該研究結果對森林土中總磷脂脂肪酸的提取研究提供一定的參考價值，具有一定的實際應用前景。

1 Hill TC J，Mcpherson EF，Harris JA，et al.Microbial biomass estimated by phospholipid phosphate in soils with diverse microbial communities.Soil Biol Biochem，1993，25:1779-1786.

2 Bossio DA，Scow KM，Gunapala N，et al.Determinants of soil microbial communities:effects of agricultural management，season，and soil type on phospholipid fatty acid profiles.Microb Ecol，1998，36(1):1-12.

3 Eroshin VK，Dedyukhina EG.Effect of lipids from Mortierella hygrophila on plant resistance to hytopathogens.World J ofMicrob Biot，2002，18:165-167.

4 Banks ML，Kennedy AC，Kremer JR，et al.Soil microbial community response to surfactants and herbicides in two soils.Appl Soil Ecol，2014，74(2):12-20.

5 Bligh EG，Dyer WJ.A rapid method of total lipid extraction and purification.Can J Bio Physiol，1959，37:911-917.

6 Tunlid A，Barid BH，Trexler MB，et al.Determination of phospholipids ester-linked fatty acid and polyβ-hydroxybutyrate for the stimulation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.).Can J Microb，1985，31:1113-1119.

7 Drenovsky RE，Elliott GN，Graham KJ，et al.Comparison of phospholipids fatty acid (PLFA)and total soil fatty acid methyl esters (TSFAME)for characterizing soil microbial communities.Soil Biol Biochem，2004，36:1793-1800.

8 Frosteg?rd ?，Tunlid A，B??th E.Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content.J Microb Meth，1991，14(3):151-163.

9 Zhang QL(張秋龍)，Liang YX(梁永欣)，Li WC(李文聰)，et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from Hypecoum leptocarpum Hook.F.et Thoms by response surface analysis.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，25:841-845.