梅妍妍 高 超 崔 蕾 李偉京 趙曉曦 吳敏媛 李志剛

·論著·

半胱氨酸蛋白酶8相關(guān)蛋白2 及微小殘留病灶的聯(lián)合檢測(cè)在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中的預(yù)后意義

梅妍妍 高 超 崔 蕾 李偉京 趙曉曦 吳敏媛 李志剛

目的 研究急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒初診骨髓樣本中半胱氨酸蛋白酶8相關(guān)蛋白2 (CASP8AP2)的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 2008年4月至2009年8月，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院收治的初發(fā)兒童ALL為研究對(duì)象，使用RQ-PCR 方法檢測(cè)初診骨髓樣本中CASP8AP2的表達(dá)水平。根據(jù)ROC曲線界值將CASP8AP2水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組；以第33天微小殘留病灶(MRD)水平分為MRD高表達(dá)和低表達(dá)組；以CASP8AP2聯(lián)合第33天MRD表達(dá)水平分為高危組、中危組和低危組。分析CASP8AP2、MRD以及兩者聯(lián)合對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值。結(jié)果 81例ALL患兒納入分析，男女比例1.6∶1。①?gòu)?fù)發(fā)組CASP8AP2表達(dá)顯著低于非復(fù)發(fā)組，(0.45±0.31)vs(0.77±0.35),P= 0.0021；CASP8AP2高表達(dá)和低表達(dá)組的復(fù)發(fā)率分別為3.2%(2/62)和42.1%(8/19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，ROC曲線下面積(AUC)為0.851，95%CI：0.700～1.002。②MRD高表達(dá)組和低表達(dá)組復(fù)發(fā)率分別為23.7%(9/38)和2.3%(1/43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線分析顯示，AUC為0.890, 95%CI:0.773～1.007。③CASP8AP2-MRD低危組37例無復(fù)發(fā)，中危組2/31例(6.4%)復(fù)發(fā)，高危組8/13例(6.2%)復(fù)發(fā)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CASP8AP2-MRD高危組的無事件生存時(shí)間及總生存時(shí)間顯著低于中危組和低危組。ROC曲線分析顯示，AUC為0.917，95%CI：0.837～0.997。結(jié)論 CASP8AP2的表達(dá)水平結(jié)合MRD可準(zhǔn)確的判斷兒童ALL的預(yù)后。

急性淋巴細(xì)胞白血病； 半胱氨酸蛋白酶8相關(guān)蛋白2； 微小殘留病灶； 聯(lián)合檢測(cè)； 預(yù)后； 兒童

白血病在1～14歲兒童腫瘤中居于首位，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)約占26.8%，是兒童期最常見的惡性腫瘤[1]。近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)的提高及基于白血病初診危險(xiǎn)度分型的治療，能夠較為準(zhǔn)確地劃分患兒的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)度，并采取相應(yīng)的治療方案，兒童ALL的治愈率現(xiàn)已達(dá)到80%，是當(dāng)前療效最好、治愈率最高的惡性腫瘤之一，然而仍有20%患兒經(jīng)歷復(fù)發(fā)。微小殘留病灶(MRD)是兒童ALL預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志物，然而并非所有MRD高表達(dá)的患兒均復(fù)發(fā)，且許多MRD低表達(dá)的患兒可經(jīng)歷復(fù)發(fā)，所以尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物，更早、更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，并采取相關(guān)干預(yù)措施是臨床及科研的重點(diǎn)[2,3]。

半胱氨酸蛋白酶8相關(guān)蛋白2 (Caspase 8 associated protein 2，CASP8AP2)是Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等生物學(xué)過程中的關(guān)鍵因子[4～6]，F(xiàn)lotho等[7]首次報(bào)道了CASP8AP2在兒童ALL中的預(yù)后價(jià)值，即 CASP8AP2的低表達(dá)與ALL的不良預(yù)后相關(guān)。然而Yang等[8]的研究并未進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論。

本研究利用RQ-PCR的方法，以長(zhǎng)期持續(xù)完全緩解(CCR)≥5年的ALL患兒骨髓樣本為對(duì)照，對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)北京兒童醫(yī)院(我院)ALL患兒初診骨髓樣本CASP8AP2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討CASP8AP2及MRD的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)ALL的預(yù)后意義。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①我院診斷的初發(fā)兒童ALL，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫分型診斷標(biāo)準(zhǔn)符合文獻(xiàn)[9,10]；②初診骨髓涂片幼稚細(xì)胞比例≥70%[11]；③采用中國(guó)兒童白血病協(xié)作組(CCLG-2008)方案治療[12]；④初發(fā)入院診斷治療出院后隨訪時(shí)間≥36個(gè)月。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①骨髓細(xì)胞樣本量不足不能進(jìn)行基因檢測(cè)者；②未完成CCLG-2008方案治療者。

1.3 CASP8AP2的定量檢測(cè) 取患兒骨髓標(biāo)本分離單個(gè)核細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書提取總mRNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260和A280，計(jì)算A260/A280以確定RNA純度，計(jì)算RNA濃度(A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000)。采用隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)RNA為cDNA。①孵育：總RNA 2 μg，隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物1 μL，加DEPC水至13.5 μL，70℃溫育5 min；②逆轉(zhuǎn)錄：5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL，加dNTP至每種2 mmol，RNA酶抑制劑0.5 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，混勻后加入孵育好的RNA中，37℃逆轉(zhuǎn)錄62 min。CASP8AP2定量PCR引物及探針序列由Primer Express(美國(guó)Applied Biosystems公司)軟件設(shè)計(jì)，正向序列(5′-3′)為CACTTGCCACTTCTACAAGTC，反向序列(5′-3′)為TGGCGGCTAAATATGCAAATG，探針序列為FAM-TGTCAGAAAAGAGGGCCATCATTTAAA-TAMRA，ABL引物探針序列引自參考文獻(xiàn)[13]。

CASP8AP2及ABL基因定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：12.5 μL體系中含RoxMix 6.25 μL，上、下游引物各10.0 pmol，探針2.5 pmol，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件： 95℃10 min, 95℃ 15 s，60℃ 1 min 50個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以5例來自我院血液病中心長(zhǎng)期CCR≥5年的ALL患兒骨髓樣本為對(duì)照。結(jié)果均以該5例患兒的平均CT值進(jìn)行校正，采用 2-ΔΔCt 的方法進(jìn)行計(jì)算[14]，表示與5例CCR患兒相比，增加或減少的倍數(shù)。

1.4 MRD檢測(cè) 采用RQ-PCR的方法，以免疫球蛋白/T細(xì)胞受體(Ig/TCR)基因重排為分子標(biāo)志，檢測(cè)第33天誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)的MRD水平[15]。

1.5 分組 ①以CASP8AP2的受試者特征工作(ROC)曲線計(jì)算的最適臨界值(敏感度和特異度均>80%)分為CASP8AP2高表達(dá)和低表達(dá)組；②以第33天MRD水平(≥10-4或<10-4)分為MRD高表達(dá)和低表達(dá)組；③結(jié)合CASP8AP2及第33天MRD水平，分為CASP8AP2-MRD高危組(CASP8AP2低表達(dá)，MRD高表達(dá))、中危組(CASP8AP2高表達(dá)，MRD高表達(dá)或CASP8AP2低表達(dá)，MRD低表達(dá))和低危組(CASP8AP2高表達(dá)，MRD低表達(dá))。

1.6 觀察指標(biāo) 復(fù)發(fā)率、無事件生存時(shí)間(EFS)和總生存時(shí)間(OS)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2008年4月至2009年8月共有195例初發(fā)ALL患兒，81例進(jìn)入分析，納入與排除流程見圖1。男50例(61.7%)，女31例。年齡1～9歲64例(79.0%)，≥10歲17例；WBC≥50×109·L-126例。潑尼松反應(yīng)良好78例。中樞系統(tǒng)白血病2例。BCR-ABL基因陽性5例，TEL-AML1基因陽性22例，MLL-AF4基因陽性1例，E2A-PBX1基因陽性8例。B-ALL 71例(87.6%)，T-ALL 10例，中位初診年齡為6(1～14)歲，中位隨訪時(shí)間38(2～50)個(gè)月，處于完全緩解狀態(tài)71例，骨髓或髓外復(fù)發(fā)10例(12.3%)。

圖1 病例篩選流程圖

Fig 1 Flow chart of study subjects

2.2 CASP8AP2的表達(dá)情況 復(fù)發(fā)的10例患兒CASP8AP2的表達(dá)水平為0.45±0.31，顯著低于非復(fù)發(fā)患兒的0.77±0.35，P=0.0021。ROC曲線分析顯示AUC為0.851，95%CI：0.700～1.002(圖2A)，CASP8AP2界值為0.4760時(shí)的敏感度為84.5%，特異度為80.0%。據(jù)此分為CASP8AP2高表達(dá)組(n=62)和低表達(dá)組(n=19)。

2.3 CASP8AP2、MRD指標(biāo)評(píng)估預(yù)后的價(jià)值 CASP8AP2高表達(dá)組和低表達(dá)組的復(fù)發(fā)率分別為3.2%(2/62)和42.1%(8/19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Kaplan-Meier 生存分析顯示，與CASP8AP2高表達(dá)組相比，CASP8AP2低表達(dá)組具有較差的EFS及OS(圖3A,B)

MRD高表達(dá)組和低表達(dá)組復(fù)發(fā)率分別為23.7%(9/38)和2.3%(1/43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。ROC AUC為0.890, 95%CI:0.773～1.007(圖2B)。

CASP8AP2-MRD低危組37例無復(fù)發(fā)，中危組2/31例(6.4%)復(fù)發(fā)，高危組8/13例(6.2%)復(fù)發(fā)，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CASP8AP2-MRD高危組的EFS(圖3C)及OS( 圖3D)顯著低于中危組和低危組。ROC曲線分析顯示，AUC為0.917，95%CI：0.837～0.997(圖2C)。

圖2 CASP8AP2、MRD和CASP8AP2-MRD預(yù)測(cè)兒童ALL復(fù)發(fā)的ROC曲線

Fig 2 ROC curve of CASP8AP2, MRD and CASP8AP2-MRD to predict the relapse of pediatric ALL

Notes A:CASP8AP2,AUC was 0.851(95%CI:0.700-1.002). B:MRD, AUC was 0.890(95%CI:0.773-1.007). C: CASP8AP2-MRD, AUC was 0.917(95%CI:0.837-0.997)

圖3 CASP8AP2和CASP8AP2-MRD的無事件生存時(shí)間和總生存時(shí)間

Fig 3 EFS and OS of CASP8AP2 and CASP8AP2-MRD

Notes A,B:CASP8AP2; C,D: CASP8AP2-MRD

3 討論

臨床及生物學(xué)因素包括年齡、性別、初診幼稚細(xì)胞數(shù)、免疫表型及MRD已經(jīng)證實(shí)是兒童ALL的預(yù)后因素[16]。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白分子如CASP8AP2[7]、細(xì)胞色素C相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白酶(CRAC)[17]及Ras、Aven等[18]與兒童ALL預(yù)后相關(guān)。然而，CASP8AP2在兒童ALL中的預(yù)后意義尚存在爭(zhēng)議。CASP8AP2是Fas誘導(dǎo)的參與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等生物學(xué)過程中的關(guān)鍵因子[4～6]，本研究證實(shí)了CASP8AP2在兒童ALL中的預(yù)后價(jià)值，即 CASP8AP2的低表達(dá)與較高的MRD水平與ALL的血液學(xué)復(fù)發(fā)相關(guān)，與Flotho等[7]對(duì)99例ALL患兒研究結(jié)果基本一致，該研究根據(jù)CASP8AP2的表達(dá)分成病例數(shù)相同的高、中和低表達(dá)組；而本研究根據(jù)ROC曲線的界值分為CASP8AP2高表達(dá)和低表達(dá)組，分組依據(jù)更為合理。

Yang等[8]研究中并未發(fā)現(xiàn)CASP8AP2在兒童ALL中的預(yù)后價(jià)值，進(jìn)一步分析該文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該研究中未提及入組病例初診時(shí)骨髓樣本中的幼稚細(xì)胞數(shù)百分比，提示CASP8AP2表達(dá)水平有一部分可能是來自正常細(xì)胞而非白血病細(xì)胞。

MRD是指白血病經(jīng)過治療CR后殘留在體內(nèi)少量白血病的狀態(tài)。在誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)MRD水平≥10-4者通常預(yù)后不良，且多數(shù)經(jīng)歷復(fù)發(fā)，但實(shí)際上復(fù)發(fā)率僅為15%，且MRD<10-4患兒也可經(jīng)歷復(fù)發(fā)[2]。本研究38例MRD≥10-4患兒中，CASP8AP2低表達(dá)者7/13例復(fù)發(fā)；23/25例CASP8AP2高表達(dá)者CCR。1例MRD<10-4的復(fù)發(fā)患兒，其CASP8AP2為低水平表達(dá)。進(jìn)一步依據(jù)CASP8AP2聯(lián)合MRD分組的結(jié)果顯示，CASP8AP2-MRD低危組有較低復(fù)發(fā)率，較長(zhǎng)EFS及OS。ROC曲線分析顯示，CASP8AP2-MRD AUC為0.917，高于單獨(dú)CASP8AP2和MRD的AUC，具有更高的預(yù)測(cè)價(jià)值，提示CASP8AP2聯(lián)合MRD檢測(cè)可較好的預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。該結(jié)果在應(yīng)用前可能還需在其他研究樣本中加以驗(yàn)證。

低表達(dá)CASP8AP2導(dǎo)致兒童ALL骨髓復(fù)發(fā)的具體機(jī)制目前尚不明確。CASP8AP2是參與CD95(Fas)及其配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵因子，可導(dǎo)致CASP8AP2的核-線粒體易位并激活caspase 8[6]。因此，CASP8AP2的低表達(dá)可能導(dǎo)致白血病細(xì)胞凋亡程序發(fā)生差錯(cuò)并產(chǎn)生耐藥性。此外，CASP8AP2也是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的一個(gè)重要因素。多數(shù)ALL化療藥物，如氨甲喋呤、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、硫鳥嘌呤及阿糖胞苷能更有效地作用于迅速分化的白血病細(xì)胞，而CASP8AP2低表達(dá)的白血病細(xì)胞增殖緩慢，可能降低對(duì)藥物的反應(yīng)[7]。因此，低表達(dá)CASP8AP2相關(guān)的增殖分化能力降低可能也導(dǎo)致了高M(jìn)RD以及骨髓復(fù)發(fā)。CASP8AP2在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖分化中作用的進(jìn)一步研究，能為其在兒童ALL中的預(yù)后機(jī)制的探索提供依據(jù)。

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Prognostic significance of CASP8AP2 and joint detection of minimal residual disease in pediatric acute lymphoblastic leukemia

MEIYan-yan,GAOChao,CUILei,LIWei-jing,ZHAOXiao-xi,WUMin-yuan,LIZhi-gang

(DepartmentofHematology,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045,China)

LI Zhi-gang, E-mail:ericlzg@hotmail.com

ObjectiveTo investigate CASP8AP2 expression in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL), its associations with clinical characteristics, and its prognostic significance for disease relapse.MethodsClinical data of patients with newly diagnosed childhood ALL were enrolled in Beijing Children′s Hospital from April 2008 to August 2009. Using real-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR), CASP8AP2 was quantitatively detected in 81 ALL patients, ABL was detected simultaneously and used as an internal control. The average Ct value of samples obtained from five pediatric ALL patients with long-term complete continuous remission (CCR>5 years) was used as a calibrator. The expression levels of CASP8AP2 were calculated by the 2-ΔΔCt method and presented as fold changes compared with that of the five CCR patients.ResultsEighty-one children diagnosed with ALL were included in the study. The ratio of males to females was 1.6. ①The ROC curve of CASP8AP2 was made to predict the relapse of pediatric ALL, and the area under the curve (AUC) was 0.851(P<0.001). ② The expression of CASP8AP2 in the unfavorable prognosis group was significantly lower than that in the favorable prognosis group, (0.45±0.31)vs(0.77±0.35),P=0.0021. ③ Using a cutoff value of 0.4760, CASP8AP2 may be divided into high- and low-expression groups. Significantly poorer event-free survival (EFS) (P<0.001) and overall survival (OS) (P<0.001) were found in the low-expression group. ④ Using the expressions of CASP8AP2 and minimal residual disease (MRD) as bases, samples were divided into three risk groups. Differences between groups were statistically significant and indicated the capacity to predict the relapse of disease (AUC=0.917,P<0.001).ConclusionsThe expression of CASP8AP2 could be an independent prognostic factor for pediatric ALL. Joint detection of CASP8AP2 and MRD could help predict outcomes more precisely and has the potenticals to be sued as an effective means in determining prognosis, monitoring the risk of recurrence, and guiding the treatment.

Acute lymphoblastic leukemia; Caspase 8 associated protein 2； Minimal residual disease; Joint detection; Prognosis; Children

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題：2011ZX09302-007-01；國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題：2007BAI04B03

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液病中心 北京，100045

李志剛，E-mail:ericlzg@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.008

2013-01-07

2013-03-20)

張崇凡)