朱長(zhǎng)皓，張?zhí)熘?，胡克，張啟英，郭兆彬，顧?/p>

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009)

大部分的細(xì)胞培養(yǎng)研究都在二維表面進(jìn)行，如微孔板、組織培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿［1-3］，該方法簡(jiǎn)單、快捷、細(xì)胞存活率較高。這種傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)明顯地促進(jìn)了對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的理解，但同時(shí)也存在缺點(diǎn)。在體內(nèi)，幾乎所有的組織細(xì)胞都生活在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，這些ECM包含了復(fù)雜的三維纖維網(wǎng)絡(luò)，提供復(fù)雜的生物和物理信號(hào)［4］。二維基板在模擬三維微環(huán)境這方面有所限制，因?yàn)槿狈σ欢ǖ慕Y(jié)構(gòu)和材料的局限性。此外，生長(zhǎng)在二維剛性基板上的細(xì)胞需要有相當(dāng)大的適應(yīng)性，因?yàn)槠淙狈μ囟ǖ腅CM。這些缺點(diǎn)可能會(huì)改變細(xì)胞的新陳代謝，降低其相應(yīng)的功能。出于這個(gè)原因，二維細(xì)胞培養(yǎng)不僅影響細(xì)胞復(fù)雜的動(dòng)態(tài)的生長(zhǎng)環(huán)境，而且有可能歪曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因?yàn)檫@是強(qiáng)制細(xì)胞適應(yīng)這種環(huán)境而獲得的檢測(cè)結(jié)果［5-7］。三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)或者稱為支架，克服了二維的限制，這些基質(zhì)或者支架都是多孔結(jié)構(gòu)，可以支持細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和分化。材料的多樣性和可塑性在三維基質(zhì)中更加突出，需要考慮一定的孔隙率、透氣性能、納米尺度的表面形貌。

1 材料標(biāo)準(zhǔn)

人工三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)設(shè)計(jì)的最終目標(biāo)是充分模擬體內(nèi)的ECM結(jié)構(gòu)，使得體外細(xì)胞生活的環(huán)境和其在體內(nèi)相似。ECM是由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外周質(zhì)中的物質(zhì)，主要包括纖維成分(如膠原和彈性蛋白)、連接蛋白(如纖連蛋白等)和填充分子(通常是糖胺聚糖)等。這些獨(dú)特的成分和結(jié)構(gòu)提供相應(yīng)的生物物理和生化功能，如促進(jìn)可溶性信號(hào)分子，營(yíng)養(yǎng)和代謝廢物的運(yùn)輸，并提供機(jī)械性能［8］。ECM和細(xì)胞之間的作用是動(dòng)態(tài)的、相互的，ECM可以引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化，細(xì)胞也會(huì)回饋它們的生存環(huán)境，通過降解和合成新的ECM來(lái)重塑生存環(huán)境［9-10］。

三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)必須有一定的尺度，這點(diǎn)對(duì)于模仿生物系統(tǒng)非常重要，因?yàn)榇笞匀谎苌龅男再|(zhì)往往源于多尺度、多層次結(jié)構(gòu)［11］。在這里，我們定義三維細(xì)胞基質(zhì)有3種尺度:宏觀尺度(10-1～10-3m)、微觀尺度(10-3～10-6m)、納米尺度(10-6～10-9m)。宏觀尺度結(jié)構(gòu)決定了基質(zhì)的特性包括大小和形狀，對(duì)于體外三維細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用，大小和形狀決定了其方便性和功能性［12］。在微觀尺度上的可控性對(duì)于模擬微組織結(jié)構(gòu)是相當(dāng)有價(jià)值的，如ECM中的多細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)。雖然微型結(jié)構(gòu)應(yīng)該針對(duì)于不同的部位，但是基本的設(shè)計(jì)參數(shù)如孔隙度、孔隙的連通性、幾何形狀、孔隙分布以及表面形貌是共通的［13］。微觀結(jié)構(gòu)影響三維細(xì)胞中物質(zhì)的運(yùn)輸便利。此外，微觀尺度的表面特性可以激活某些基因或者調(diào)解細(xì)胞的增殖和分化，因?yàn)榧?xì)胞和ECM之間通過納米尺度的蛋白質(zhì)進(jìn)行作用，調(diào)解各種細(xì)胞活動(dòng)來(lái)維持ECM環(huán)境［14］。因此，特別注意納米尺度的設(shè)計(jì)是無(wú)可厚非的，大部分ECM成分都是納米級(jí)的。例如膠原纖維的直徑在50～200 nm，纖維連接蛋白長(zhǎng)60～70 nm，厚3 nm［15］。除了微量營(yíng)養(yǎng)的供給，納米尺度的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提供了對(duì)大部分細(xì)胞功能有影響的表面形貌。這并不奇怪，因?yàn)樵S多細(xì)胞信號(hào)機(jī)制涉及到納米尺度的分子，納米尺度的表面已經(jīng)被證實(shí)可以調(diào)解細(xì)胞黏附、組織形態(tài)和分化［16］。

目前用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的材料分為天然材料和合成材料兩種(表1)［17］，這些材料的先天屬性已經(jīng)通過檢驗(yàn)，但是想要模擬ECM結(jié)構(gòu)，我們需要了解以下一些參數(shù):(1)生物相容性，這是一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)，因?yàn)樗鼪Q定了細(xì)胞對(duì)于材料的適應(yīng)性，即細(xì)胞不會(huì)引起明顯的排異反應(yīng)。天然材料往往表現(xiàn)出比合成材料更好的生物相容性，但是由于動(dòng)物源提高了疾病傳染的可能。合成材料制造過程更加嚴(yán)格，盡可能少使用帶毒性化學(xué)藥品來(lái)保證其生物相容性［18］。(2)潤(rùn)濕性。由于自然的ECM是完全的水合凝膠，潤(rùn)濕是一個(gè)重要的因素。更多的親水性材料對(duì)于模擬體內(nèi)環(huán)境比較好，出于這個(gè)原因，水凝膠已經(jīng)被廣泛用于三維細(xì)胞培養(yǎng)，但是水凝膠的親水性阻礙了細(xì)胞在其表面的黏附，為了克服這一缺點(diǎn)，有人采用在這些材料表面嵌入RGD短肽，以促進(jìn)細(xì)胞在其表面黏附［19］。(3)透明度。細(xì)胞體外三維培養(yǎng)需要顯微鏡的觀察，因此必須考慮到材料的透明度。許多傳感和定量分析技術(shù)，如染色和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)同樣也要使用光學(xué)儀器，還包括共聚焦顯微鏡。因此，透明材料有利于光信號(hào)通過而沒有光束消散［20］。(4)可控的生物降解性。不管是植入人體還是體外培養(yǎng)細(xì)胞，最后都必須消除這些支架。一般來(lái)說(shuō)，合成材料通過水解而天然材料通過酶降解，水降解比酶降解更有可預(yù)見性和可調(diào)節(jié)性，天然材料的酶降解更依賴于該酶的濃度［21］。(5)機(jī)械性能。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的機(jī)械性能幾乎全部體現(xiàn)在材料上，這一點(diǎn)在組織工程中體現(xiàn)比較強(qiáng)烈。例如，骨再生支架如果不能承擔(dān)足夠的負(fù)荷，就有可能在骨愈合之前斷裂。然而，過度強(qiáng)大的機(jī)械性能破壞相鄰的骨組織結(jié)構(gòu)［22］。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的選擇需綜合以上各個(gè)因素，才能更完美地模擬出細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。

表1 三維細(xì)胞培養(yǎng)常用材料

2 功能化葡聚糖三維支架

在眾多材料中，葡聚糖是天然的、非動(dòng)物源的多糖分子，它不是單糖而是低聚糖，葡聚糖按照組成它的單糖——葡萄糖的單元數(shù)目分為葡聚糖100 K、葡聚糖40 K和葡聚糖20 K等系列聚合物。葡聚糖分子式為［C6H10O5］n，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 葡聚糖結(jié)構(gòu)式

它難溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，本身雖然抗蛋白質(zhì)吸附和細(xì)胞黏附，但其結(jié)構(gòu)中含有豐富的羥基官能團(tuán)，使得它易于化學(xué)修飾，已經(jīng)被廣泛用于二維或者多孔軟組織支架、藥物釋放等領(lǐng)域。它來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜，可以通過酶來(lái)降解，完全可以用來(lái)作為三維細(xì)胞培養(yǎng)的材料［23-26］。

2.1 葡聚糖凝膠

新加坡南洋理工大學(xué)劉云蕭利用葡聚糖進(jìn)行改性合成DEX-MA-AD，使用紅外和核磁對(duì)此進(jìn)行了表征，并于平滑肌細(xì)胞進(jìn)行三維封裝培養(yǎng)。證明了葡聚糖明膠交聯(lián)的凝膠具有較高的彈性模量，也適合平滑肌細(xì)胞的三維培養(yǎng)和內(nèi)皮細(xì)胞的二維培養(yǎng)。使用葡聚糖的雙官能管與甲基丙烯酸甲酯改性，醛基與明膠上的氨基結(jié)合，紫外光交聯(lián)形成凝膠與血管平滑肌細(xì)胞封裝培養(yǎng)。以Dex-MA-AD為主要成分的水凝膠的彈性性能明顯優(yōu)于以PEG為主材料的水凝膠(圖2)。而明膠納入水凝膠中增加了細(xì)胞黏附性和酶降解性，并且增加了抗壓強(qiáng)度，通過希夫堿來(lái)改變凝膠的交聯(lián)密度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水凝膠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在二維培養(yǎng)條件下的黏附性以及三維培養(yǎng)條件下平滑肌細(xì)胞的傳播，血管增生長(zhǎng)達(dá)14 d。這種水凝膠的力學(xué)性能對(duì)于2D和3D培養(yǎng)都具有吸引力，是一種很有前途的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)［27］。

圖2 合成Dex-MA-Ly示意圖

中國(guó)科學(xué)院的蔡琴等利用葡聚糖和聚乳酸進(jìn)行混合，他采用的是溶劑鑄造法，將葡聚糖和PLA溶于二氯甲烷和笨的混合物中，但首先葡聚糖先進(jìn)行TMS的保護(hù)，葡聚糖的羥基可以通過甲醇很容易去除TMS的保護(hù)而恢復(fù)。通過此方法形成具有微孔結(jié)構(gòu)的薄膜，它是由于相分離而形成的，因?yàn)镻LA和TMSD在二氯甲烷和苯的混合液中的溶解度不同。通過這種技術(shù)，PLA和聚乳酸-葡聚糖混合支架就制作出來(lái)了，采用粒子浸出法出現(xiàn)了5～10 mm的微孔，這導(dǎo)致支架具有較高的孔隙率和開放多空結(jié)構(gòu)。通過比較純PLA和聚乳酸-葡聚糖，后者表面親水性明顯改善，它具有良好的細(xì)胞親和性和生物相容性，增強(qiáng)細(xì)胞的黏附效率，促進(jìn)細(xì)胞增殖滲透到支架內(nèi)部并進(jìn)行增殖，這種材料也是非常具有潛在前途的細(xì)胞支架［28］。

另外，加拿大的Ryan M.Lima小組利用葡聚糖和PEG不混溶性，期間葡聚糖與甲基丙烯酸酯進(jìn)行交聯(lián)。通過控制葡聚糖的甲基丙烯酸甲酯的取代程度，葡聚糖的摩爾質(zhì)量和PEG的濃度創(chuàng)造了大孔水凝膠，溶液中PEG的存在對(duì)于葡聚糖凝膠的最后形態(tài)具有非常重要的影響，導(dǎo)致形成了不同類型的結(jié)構(gòu)形態(tài)，從微孔凝膠到大孔凝膠到相互連接的串珠狀結(jié)構(gòu)，一系列的配方圖表編制使得他們確定哪種條件才能得到相互關(guān)聯(lián)的串珠狀結(jié)構(gòu)。葡聚糖大孔串珠狀結(jié)構(gòu)含有很高的水分，在89%到94%之間，通過電鏡表征形態(tài)均勻。這種支架將在小鼠3T3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中具有重要的作用，可以調(diào)查細(xì)胞滲透、細(xì)胞間相互作用［29］。

2.2 葡聚糖微載體

微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)是一種用于高產(chǎn)量培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的實(shí)用技術(shù)。CytodexTM專用于培養(yǎng)各類動(dòng)物細(xì)胞，其培養(yǎng)體積可以從數(shù)毫升到6 000 L以上。應(yīng)用Cytodex微載體技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的貼壁細(xì)胞(CHO、Cl27、Vero、COS、CV-1 等)懸浮化培養(yǎng)，每毫升培養(yǎng)液可得到數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞。微載體適于搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、攪拌罐以及WAVE生物反應(yīng)器等各種培養(yǎng)系統(tǒng)。Cytodex的設(shè)計(jì)能夠滿足微載體技術(shù)的特殊需要。它的特點(diǎn)有:(1)Cytodex的大小和密度經(jīng)優(yōu)化處理，以保證培養(yǎng)各類細(xì)胞時(shí)使其生長(zhǎng)良好，產(chǎn)量提高。(2)培養(yǎng)基架為生物學(xué)惰性，可為懸浮微載體培養(yǎng)提供堅(jiān)實(shí)而非剛性的培養(yǎng)面。(3)微載體透明，可直接使用顯微鏡觀察或染色后觀察。

Cytodex 1以交聯(lián)葡聚糖基架(cross-linked dextran matrix)為基礎(chǔ)，該基架被帶正電荷的N，N二乙胺基乙基基團(tuán)(N，N-diethylaminoethyl groups)取代，該帶電基團(tuán)遍布于整個(gè)微載體基架中。

Cytodex 3含有一層較薄的變性膠原，與交聯(lián)葡聚糖基架化學(xué)偶聯(lián)。Cytodex3上的變性膠原層易被胰蛋白酶和膠原酶等多種蛋白酶消化，因此，能在維持細(xì)胞最大活性、功能和完整性的同時(shí)將細(xì)胞從微載體上分離出來(lái)。Cytodex技術(shù)為進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)提供了新的選擇，該微載體為動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了適宜的表面，并可用于懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，還可用于增加單層細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶)及灌注室(perfusion chambers)中的細(xì)胞產(chǎn)量。其應(yīng)用范圍為大量生產(chǎn)各類細(xì)胞、病毒及重組細(xì)胞產(chǎn)物(例如干擾素、酶、核酸、激素);研究細(xì)胞貼壁、分化及細(xì)胞功能;灌注柱式培養(yǎng)系統(tǒng)(perfusion column culture systems);顯微鏡檢查研究;獲取有絲分裂細(xì)胞;分離細(xì)胞;膜研究;細(xì)胞的保存和運(yùn)輸，細(xì)胞遷移的檢測(cè)及標(biāo)記化合物的攝取研究［30］。

2.3 環(huán)境響應(yīng)型葡聚糖

很久以來(lái)人們一直在試圖通過控制凝膠體積對(duì)環(huán)境刺激的響應(yīng)性來(lái)提高多糖凝膠的生物性能，因?yàn)闇囟让舾械钠暇厶悄z能夠?qū)Νh(huán)境溫度的變化產(chǎn)生響應(yīng)，因而可以用來(lái)提高藥物釋放的效率，特別是對(duì)生物體內(nèi)葡聚糖酶含量的地方進(jìn)行靶向釋放時(shí)的效率。

天津工業(yè)大學(xué)的肖飛等在N-異丙基丙烯酰胺凝膠中引入葡聚糖，期望在保留PNIPA的溫度敏感性的基礎(chǔ)上改善凝膠的生物相容性和力學(xué)性能，使其具有更加廣泛的應(yīng)用。聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠在＞32℃時(shí)呈收縮構(gòu)象，分子表面呈疏水性，在溫度＜32℃時(shí)呈伸展構(gòu)象，分子表面呈親水性。據(jù)此，通過調(diào)節(jié)溫度可以改變固體表面的親水性。他成功合成了N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)與葡聚糖的共聚水凝膠，研究了凝膠的溶脹行為，并對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行研究。通過控制溫度的變化，實(shí)現(xiàn)凝膠材料對(duì)細(xì)胞層的自然脫附，避免酶解法對(duì)細(xì)胞功能的損傷［31］。

此外還有一些通過接枝光敏感性分子、pH敏感分子等來(lái)改性葡聚糖，以獲得環(huán)境敏感型基質(zhì)。

3 未來(lái)的發(fā)展

三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)從根本上代表了生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展，已經(jīng)取得了相當(dāng)大的成功，但是也提出了新的挑戰(zhàn)。三維細(xì)胞培養(yǎng)的趨勢(shì)是由經(jīng)驗(yàn)之談上升到系統(tǒng)的認(rèn)證方法，這就需要發(fā)展更加先進(jìn)的三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)結(jié)合生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)。同時(shí)，必須努力地制定三維細(xì)胞基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，盡管三維培養(yǎng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已經(jīng)有所體現(xiàn)，但是仍然沒有像二維培養(yǎng)那樣在研究領(lǐng)域被廣泛接受，因?yàn)槿S細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成的偏差，每次使用的基質(zhì)可能在成分上有微小的區(qū)別，很難重復(fù)得到完全一樣的ECM，這就很難重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，難以進(jìn)行系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析［32-35］。另外一個(gè)抑制其廣泛應(yīng)用的實(shí)際原因是制備成本巨大，很難大范圍推廣使用。為了彌補(bǔ)這些，必須建立一定的標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)促使研究人員充分利用三維細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。建立體外三維標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)篩選新藥物，研究癌細(xì)胞的發(fā)病機(jī)理具有相當(dāng)大的幫助，而且可以盡可能地減少動(dòng)物和人體臨床試驗(yàn)［34-36］。以下是作者對(duì)此技術(shù)的一點(diǎn)看法和建議:(1)細(xì)胞播種方法需要加以改進(jìn)，必須知道均勻分布在三維基質(zhì)中的細(xì)胞的精確數(shù)量，因?yàn)榧?xì)胞的數(shù)目影響支架與支架之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較。(2)目前的細(xì)胞培養(yǎng)液應(yīng)該加以重新考慮，因?yàn)榕囵B(yǎng)基成分的突然變化會(huì)擾亂預(yù)先存在的可溶性的信號(hào)分子的濃度和分布梯度。(3)目前所有的培養(yǎng)模式都比較溫和，沒有考慮到外界的機(jī)械刺激和電刺激，而體內(nèi)環(huán)境則有一定的機(jī)械壓力及電荷分布，可以通過一定的外界刺激來(lái)探討細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。(4)目前三維細(xì)胞分析方法必須加以改進(jìn)，包括共聚焦和micro-CT圖像分析。這些改良必將影響三維細(xì)胞培養(yǎng)的效果，并加速滲透到其他領(lǐng)域的應(yīng)用。(5)除了上述部分，一套獨(dú)特的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生活狀態(tài)的技術(shù)是未來(lái)發(fā)展的方向［37-38］。

4 總 結(jié)

以模擬天然細(xì)胞的生活環(huán)境為目的的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，推動(dòng)了材料和制造技術(shù)的發(fā)展。在三維細(xì)胞培養(yǎng)過程中，材料的形態(tài)和制作都在不斷研制，對(duì)于任何細(xì)胞都適用的理想的三維細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)仍待建立。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)的重要性和必要性在組織和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛報(bào)道，使用三維細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)獲得有意義的數(shù)據(jù)是多學(xué)科集合的結(jié)果。解決這些挑戰(zhàn)的過程中會(huì)帶來(lái)細(xì)胞生物學(xué)的革命，從二維平面生物學(xué)轉(zhuǎn)向三維立體生物學(xué)，換句話說(shuō)就是三維細(xì)胞培養(yǎng)將是生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展的關(guān)鍵。另外，葡聚糖以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，未來(lái)將在三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的應(yīng)用中占有一席之地。

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