于宗良，陳樂，楊向軍

(1.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇昆山 215300;2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇蘇州 215006)

與缺血預(yù)適應(yīng)相比，現(xiàn)有的研究相繼表明缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning，IP)同樣可以減輕急性心肌缺血再灌注損傷，也可減少梗死心肌面積等［1-5］。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是一類新型的拮抗心肌細(xì)胞凋亡、提高心肌細(xì)胞活力、促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子［6-9］，因而將IP和G-CSF應(yīng)用治療急性心肌梗死受到較多的關(guān)注，但確切的臨床療效仍有較大爭議［5，9］。本研究從心肌缺血再灌注損傷、心室重構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)等三方面，探究二者聯(lián)合應(yīng)用對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)及其可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制作

體重在2.2～2.8 kg之間的健康雄性新西蘭白兔，3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉后開胸暴露心臟，在左心耳下緣與心尖連線中點之間的連接面上，采用雙線雙結(jié)法結(jié)扎心臟冠狀動脈左室支(LVA)［10］。以結(jié)扎局部心肌的搏動明顯減弱、蒼白，心電圖ST-T改變及血肌鈣蛋白I(cTnI)升高為模型制作成功標(biāo)志。

1.2 藥物及劑量

G-CSF注射液(商品名:潔欣;蘇州中凱生物制藥;批號:藥準(zhǔn)字 S19991002)，劑量為10μg·kg-1·d-1，采用皮下注射，缺血再灌注12 h后給藥，連用5 d。

1.3 分組及處理

將建模成功的動物隨機(jī)分為4組，即:單純?nèi)毖俟嘧φ战M(IR組)，松開結(jié)扎的線結(jié)后立即進(jìn)行再灌注，12 h后開始皮下注射生理鹽水0.5 ml，每天1次，連續(xù)5 d;粒細(xì)胞集落刺激因子組(G-CSF組)，在單純?nèi)毖俟嘧⒔M的基礎(chǔ)上，于再灌注12 h后皮下注射G-CSF;IP組，在再灌注開始的1 min內(nèi)通過周期性結(jié)扎和松解LVA的線結(jié)，進(jìn)行缺血30 s/再灌注30 s的連續(xù)循環(huán)4次的IP處理，最后完全恢復(fù)左室支血流，再灌注12 h后皮下注射生理鹽水0.5 ml;G-CSF+IP組，聯(lián)合采用IP及G-CSF進(jìn)行干預(yù)。所有受試白兔在再灌注15 min后縫合胸腔，精心飼養(yǎng)。在缺血再灌注以及治療過程中，增補(bǔ)死亡動物，保證每組完成實驗數(shù)為15只。

1.4 外周血白細(xì)胞計數(shù)及cTnI檢測

麻醉后抽取股靜脈血2 ml，分別進(jìn)行外周血白細(xì)胞計數(shù)及cTnI檢測，飼養(yǎng)7 d后再次抽取股靜脈血測定cTnI及外周血白細(xì)胞計數(shù)。

1.5 超聲心動圖測定

4個實驗組的新西蘭兔飼養(yǎng)4周，使用二維切面及M超聲，測量左房內(nèi)徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、左室舒張期末徑、左室收縮期末徑、左室短軸縮短率，估算射血分?jǐn)?shù)(EF)以評價心功能。

1.6 組織病理學(xué)檢查

在超聲心動圖檢查后靜脈注射空氣處死兔，分離心臟進(jìn)行大體標(biāo)本檢查，壞死心肌染色并觀察超微結(jié)構(gòu)。心臟標(biāo)本于-80℃冷凍半小時后，采用振動切片沿左室長軸將左室橫切為厚約2 mm的薄片，在電子天平上稱重后置于1%TTC溶液染色。灰白色部分為梗死心肌，磚紅色部分為存活心肌，分離心肌，濾紙吸干染液后分別稱重。梗死心肌面積為梗死心肌重量與左室心肌總重量的百分比。采用透射電子顯微鏡(JSM-840)進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)整理和分析采用SPSS 13.0軟件完成。數(shù)值變量資料以±s表示，分類變量資料以百分比(%)表示，兩樣本均數(shù)的比較采用成組資料t檢驗，同一組處理前后的比較采用配對t檢驗，多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)中心電監(jiān)測(缺血再灌注前后ST段變化)

實驗動物結(jié)扎LVA后數(shù)分鐘內(nèi)，心電監(jiān)護(hù)(Ⅱ?qū)?lián))就顯示ST段較結(jié)扎前明顯抬高;而在松結(jié)再灌注后，采用后適應(yīng)處理的再灌注的兩組實驗兔的ST段回落明顯加快，和單純?nèi)毖俟嘧⒔M的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

表1 缺血15 min及再灌注15 min對新西蘭兔Ⅱ?qū)?lián)ST段的影響 mmTab 1 ST-segment(leadⅡ)resolutions before and after reperfusion in each group mm

2.2 外周血白細(xì)胞計數(shù)

從表2可以看出，和手術(shù)前相比，給予G-CSF可以明顯升高外周血白細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)，這一結(jié)果顯示了G-CSF的造血動員作用。

2.3 cTnI含量的變化

術(shù)后7 d各組的cTnI含量均較術(shù)前有所升高，但G-CSF、IP、G-CSF+IP組的升高幅度明顯低于IR組(P＜0.05)(表3)。

表2 實驗動物術(shù)前及術(shù)后7 d外周血白細(xì)胞數(shù)Tab 2 WBC before and 7 d after operation in each group

表3 缺血再灌注各組術(shù)前及術(shù)后cTnI水平Tab 3 cTnI before and 7 d after operation in each group

2.4 心功能及心室重構(gòu)

術(shù)后4周超聲心動圖檢查提示單純IR組的平均左室舒張末期直徑(LVIDd)最大，提示其收縮功能恢復(fù)最差;而IP+G-CSF組的心室重構(gòu)最輕，LVEF也明顯優(yōu)于其他3組(P＜0.05)，見表4。

表4 不同處理方式對缺血再灌注兔術(shù)后4周心功能的影響Tab 4 Ultrasound cardiography 4 weeks after operation in each group

2.5 梗死心肌面積

從表5可見，與 IR 組相比，G-CSF、IP、G-CSF+IP組心肌梗死面積均明顯減少。與G-CSF組及IP組相比，G-CSF+IP組梗死范圍稍小，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

采用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)IR組肌絲排列紊亂，線粒體腫脹明顯，有部分空泡變。G-CSF組仍有肌絲排列輕度紊亂，但未見肌絲溶解，且線粒體腫脹也不明顯。IP組的肌絲排列稍不整齊，未見肌絲溶解，線粒體仍有腫脹。G-CSF+IP組的肌絲排列基本整齊，同樣未見肌絲溶解，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整(圖1)。采用后適應(yīng)、G-CSF干預(yù)后，肌絲和線粒體損傷程度均明顯減輕，G-CSF+IP組的減輕幅度最大。

表5 不同處理方式對缺血再灌注兔心肌梗死面積的影響Tab 5 The weight of LV，MI，and infarct size in each group

圖1 不同處理方式對缺血再灌注兔心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 ×15 000Fig 1 Transmission electron microscope diversify of cardiomyocytes in each group ×15 000

3 討 論

防治急性心肌梗死的關(guān)鍵是采用急診冠脈介入治療、溶栓等措施進(jìn)行及時再灌注，但是由此引發(fā)的再灌注損傷卻又大大降低了再灌注的獲益，因而有效預(yù)防再灌注損傷是提高急性心梗治療效果的重要保證。本研究率先采用IP優(yōu)化再灌注同時給予促進(jìn)心肌功能修復(fù)的G-CSF，發(fā)現(xiàn)與單純?nèi)毖俟嘧⑾啾龋琁P或GCSF均能顯著減輕心肌損傷、縮小梗死心肌面積，同時IP或G-CSF組的心室重構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)損傷較IR組明顯減輕，而其中IP與G-CSF聯(lián)合應(yīng)用的心肌保護(hù)作用較單用IP或G-CSF更好。

IP是指心肌急性缺血后在進(jìn)行較長時間的再灌注之前，給予快速短暫的一次或數(shù)次重復(fù)缺血/再灌注，這一措施能夠提高心肌對缺血后再灌注損傷的耐受性，減少缺血/再灌注損傷［2］。如此同時，如何促進(jìn)梗死心肌的修復(fù)則是另一難題，已有研究發(fā)現(xiàn)G-CSF能夠動員骨髓間質(zhì)干細(xì)胞直接分化為心肌細(xì)胞，迅速趨化到受損心肌，促進(jìn)壞死心肌的修復(fù);G-CSF也可通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)血管再生，另外G-CSF還能直接作用于靶細(xì)胞上的受體抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［9］。目前的動物實驗及部分臨床試驗已證實IP和G-CSF確實具有心肌保護(hù)作用，因而這兩者的臨床應(yīng)用值得探討，特別是急診冠脈介入治療術(shù)的發(fā)展為IP和 G-CSF 的臨床應(yīng)用提供了可行性［5，9］。

本實驗首次采用G-CSF聯(lián)合IP干預(yù)急性心肌缺血性梗死，首先IP可以減少再灌注損傷，其次外周血白細(xì)胞計數(shù)顯示采用G-CSF的劑量和給藥時間確實動員了機(jī)體骨髓干細(xì)胞，提示G-CSF的保護(hù)機(jī)制與細(xì)胞動員和誘導(dǎo)分化有關(guān)。我們的研究結(jié)果也表明，聯(lián)合應(yīng)用G-CSF與IP治療急性心肌梗死不僅減輕缺血再灌注損傷，也促進(jìn)了心功能的恢復(fù)，同時超微結(jié)構(gòu)損傷的逆轉(zhuǎn)也為心肌的后期修復(fù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，而且聯(lián)合應(yīng)用的效果明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用。

我們的研究為IP與G-CSF的聯(lián)合應(yīng)用治療心肌急性缺血再灌注損傷提供了一定的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)，但是二者聯(lián)合治療的分子生物學(xué)機(jī)制、最佳的聯(lián)合治療方式等等尚需要更深入的研究。

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