繆輝宇 萬 雷 陳 宇 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院（廣州510240）

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種慢性關(guān)節(jié)疾患，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨退化以及損害后關(guān)節(jié)內(nèi)骨的增生、變形導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能改變甚至功能喪失。我國(guó)患膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的人數(shù)占總?cè)丝诩s3%，其中55歲以上人群在X線上有膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)者約占6%，65歲以上老年人膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)85%［1，2］。目前該病的治療尚未取得突破性進(jìn)展，防治OA 已成為當(dāng)今國(guó)際上的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有西醫(yī)治療多以非甾體類抗炎藥緩解癥狀為主，但長(zhǎng)期使用后胃腸道毒副作用明顯，常使患者不能耐受而終止治療。相對(duì)而言，針刺療法具有簡(jiǎn)便價(jià)廉且適合長(zhǎng)期使用的特點(diǎn)，故越來越引起了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。針刺療法在治療OA方面的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致OA 關(guān)節(jié)破壞的主要原因是軟骨合成和分解代謝的失衡［3，4］，這種失衡很大程度在于病變關(guān)節(jié)部位細(xì)胞因子的異?；顒?dòng)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF－β1）和腫瘤壞死因子（TNFα）參與軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，和軟骨代謝關(guān)系最為密切。為了探索針刺防治OA 的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制，本課題引入TGF－β1、TNFα細(xì)胞因子，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究針刺對(duì)TGFβ1、TNFα的影響，探討針刺防治OA的作用機(jī)理。

1 材料與方法 1.1 動(dòng)物 新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0Kg，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大白兔均飼養(yǎng)于恒溫恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為（25±1）℃，濕度70%，每天12h光照／黑暗，任意進(jìn)食飼養(yǎng)者提供的大白兔標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 分組與造模 將新西蘭大白兔30只隨機(jī)分為2組，即造模組27只，正常組3只。正常組不予任何處理，造模組用戊巴比妥鈉（30mg／kg）靜脈注射麻醉，消毒膝關(guān)節(jié)皮膚，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3mL通過髕上韌帶兩側(cè)注入兔膝關(guān)節(jié)腔，每3d1次，連續(xù)注射3次。術(shù)后持續(xù)1周肌注青霉素20萬U／d以預(yù)防感染。動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，木瓜蛋白酶末次注入后第2天，以空氣栓塞法處死C組動(dòng)物，解剖左膝關(guān)節(jié)，于脛骨平臺(tái)處切取關(guān)節(jié)軟骨組織，觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)變化，評(píng)估造模是否成功。

2.2 干預(yù)方法 造模成功后再隨機(jī)分3組，即模型組，針刺組，西樂葆組，每組8只。模型組不作任何處理，針刺組行針刺治療，西樂葆組予西樂葆灌胃給藥。

西樂葆組動(dòng)物按24mg／d／只灌服西樂葆，每天1次，連續(xù)灌胃36d。

針刺組：取穴“內(nèi)外膝眼”、“鶴頂”、“梁丘”、“血?！薄ⅰ白闳铩?，備皮，穴位局部常規(guī)消毒，以毫針進(jìn)行針刺，行提插捻轉(zhuǎn)、平補(bǔ)平瀉手法。留針20min，每隔5min捻針1次。每天1次，10次為1個(gè)療程，療程間休息3d，再行下1個(gè)療程，共針刺3個(gè)療程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死全部新西蘭兔，取左膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)液進(jìn)行觀察和檢測(cè)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 2.3.1 關(guān)節(jié)軟骨組織的形態(tài)學(xué)觀察 取股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨，用10%中性多聚甲醛溶液固定24h后，EDTA脫鈣4～8w。HE染色：脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，染色。觀察軟骨層的完整性、軟骨細(xì)胞的分布及數(shù)量、潮線及軟骨下骨的改變。進(jìn)行Mankin評(píng)分（1～5分為早期，6～9分中期，10～14分為晚期）［5］，驗(yàn)證造模成功。

2.3.2 關(guān)節(jié)液的抽取檢測(cè) 關(guān)節(jié)液的抽?。和孟ゲ棵薷蓛簦?.5mL一次性無菌注射進(jìn)行膝關(guān)節(jié)穿刺，注入無菌生理鹽水1mL，反復(fù)抽吸、注入3～5次，使沖洗液混勻，最后盡量抽盡膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體。將抽取的關(guān)節(jié)液3000r／min 離心20min，收集上清液，最后得關(guān)節(jié)液0.5mL／膝，置于－20℃低溫冰箱保待檢采用ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中TGF－β1和TNF－α的水平，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用方差分析，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果 3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)共納入30只白兔，其中6只用于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型驗(yàn)證，最后24只進(jìn)入結(jié)果分析，無脫落，見表1。

3.2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)Mankin′s評(píng)分 Mankin′s評(píng)分結(jié)果顯示，模型組Mankin′s評(píng)分較正常組明顯升高（P＜0.01），說明造模成功。針刺組和西樂葆組Mankin′s評(píng)分均較模型組低（P＜0.01），但兩組間差異無顯著性意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)Mankin′s評(píng)分結(jié)果

表2 造模后三組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)Mankin′s評(píng)分結(jié)果

3.3 三組兔膝關(guān)節(jié)液中TGF－β1和TNF－α的水平比較 見表3 兔膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生后，關(guān)節(jié)液中TNF－α的水平明顯增高（P＜0.01），TGF－β1水平明顯降低。針刺和西樂葆治療后關(guān)節(jié)液中TNF－α水平較模型組顯著降低（P＜0.01），兩組間比較差異無顯著性意義（P＞0.05）；而TGF－β1水平較模型組明顯升高（P＜0.01），且兩組間比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。

表3 三組兔膝關(guān)節(jié)液中TGF－β1和TNF－α的水平比較

4 討 論 膝骨關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)于中老年人的慢性退行性疾病，其主要病理特征是膝關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞數(shù)目的減少和軟骨基質(zhì)的降解。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞因子在OA中的作用越來越受到人們的關(guān)注。細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一組具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和合成的蛋白質(zhì)或多肽對(duì)骨和軟骨的形成與修復(fù)起局部調(diào)節(jié)作用。其中TGF－β1表現(xiàn)出多重生物學(xué)特性，是各種生長(zhǎng)因子中促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖最有效的生長(zhǎng)因子，對(duì)修復(fù)軟骨損傷具有重要作用。在牛軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，TGF－β1加快了蛋白多糖的代謝，并刺激膠原和葡糖胺聚糖在兔關(guān)節(jié)軟骨中的合成，降低細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解［5］。Aral等［6］用腺病毒介導(dǎo)將TGF－β1基因成功地轉(zhuǎn)入人軟骨樣細(xì)胞株HCS－2／8，顯著增加了軟骨特異性Ⅱ型膠原和蛋白多糖核心蛋白的表達(dá)，并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶23表達(dá)，說明TGF－β1可刺激軟骨細(xì)胞增生，促進(jìn)糖蛋白轉(zhuǎn)化，增加軟骨基質(zhì)的合成，拮抗炎癥因子，從而有利于軟骨修復(fù)。有實(shí)驗(yàn)顯示，TGF－β1不足可能是OA 的致病的重要因素之一［7］。不過，也有資料表明TGF－β1對(duì)軟骨細(xì)胞可能具有雙向調(diào)節(jié)作用［8］，一方面，它能促進(jìn)未分化的和分化早期的軟骨細(xì)胞DNA復(fù)制，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成；另一方面，對(duì)分化末期的軟骨細(xì)胞，TGF－β1則抑制其分化并抑制軟骨基質(zhì)的合成和鈣化。

TNF－α是一種多功能炎性細(xì)胞因子，主要參與激活多型核細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞的前列腺素E2（prostglandins E2，PGE2）的產(chǎn)生，增加骨和軟骨的破壞，刺激人軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶激活劑，使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶而加重關(guān)節(jié)炎損傷，同時(shí)，破骨細(xì)胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和軟骨的破壞。大量研究結(jié)果表明，TNF－α能促進(jìn)成纖維細(xì)胞釋放黏附分子，激活并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)黏附分子的表達(dá)，使血液中的白細(xì)胞通過與黏附分子相互作用被集中到關(guān)節(jié)腔參與對(duì)軟骨細(xì)胞的破壞，對(duì)于TNF－α水平增高的具體原因，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能主要與滑膜的炎性變有關(guān)［5］。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，造模成功后，模型組Mankin′s評(píng)分、TNFα水平明顯升高（P＜0.01），而TGF－β1明顯降低（P＜0.01），說明造模成功，造模后膝關(guān)節(jié)軟骨開始退化，關(guān)節(jié)腔內(nèi)促炎性細(xì)胞因子TNF－α和抗炎性細(xì)胞因子TGF－β1分泌增多。針刺和西樂葆雖然對(duì)各炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)略有所差異，但總的看來，起調(diào)節(jié)趨勢(shì)是一致的，均可降低TNF－α和升高TGF－β1。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹癥”范疇，多以肝腎不足為本，氣滯血瘀為標(biāo)，臨床治療應(yīng)從中醫(yī)角度辨證，以補(bǔ)肝腎為總治則，施以辨證論治。針刺療法是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法，具有簡(jiǎn)便價(jià)廉且適合長(zhǎng)期使用的特點(diǎn)，針刺療法在治療OA方面的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。本研究結(jié)果再次表明，針刺特定穴位可以減少關(guān)節(jié)液中TNF－α水平，改變關(guān)節(jié)局部的內(nèi)環(huán)境，對(duì)早期兔膝OA起防治作用。值得注意的是，針刺組TGF－β1水平較西樂葆組明顯升高（P＜0.01），提示針刺不僅可降低受損關(guān)節(jié)局部炎癥，更可以促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌，從而加速受損軟骨修復(fù)，顯示針刺具有良好的雙向調(diào)節(jié)作用?？傊?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示早期采用針刺特定穴位，能降低關(guān)節(jié)液TNF－α水平和升高TGF－β1水平，減輕關(guān)節(jié)軟骨退行性變。因此，調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞因子是針刺防治早期兔膝OA的作用機(jī)制之一。

［1］ 曹建中.老年骨骼疾病治療學(xué)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1993：95.

［2］ 曾慶徐，黃少弼.癥狀性骨關(guān)節(jié)炎臨床和流行病學(xué)探討［J］.中華內(nèi)科雜志，1995，34（20）：88.

［3］ Hedbom E，Hauselmann H J.Molecular aspects of pathogenesis in osteopath hits：the role of inflammation［J］.Cell Mol Life Sic，2002，59（1）：45－53.

［4］ Vanderkraan P M，Vandenberg W B.Anabolic and destructive medators in osteoarthritis［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2000，3（3）：205－211.

［5］ Both SS，Watt I，Slag boom E，et al.Innate production of tumournecrosis factor alpha and interleukin 10is associated with radiological progression of knee osteoarthritis［J］.Ann Rheum Dis，2008，67（8）：1165.

［6］ Arai Y，Kubo T，Koba Yashi K，et al.Adenovirus vector－mediated gene transduction to chondrocytes：in vitro evaluation of therapeutic efficacy of Transforming growth factorbeta 1and eat shock protein 70gene transduction［J］.Rheumatic，1997，24（9）：1787－1795.

［7］ Fang P K，MA X C，MA D L，et al.Determination of interleukin－1receptor antagonist，interleukin－10，and transforming growth factorbeta1in synovial fluid aspirates of patients with temporomandibular disorders ［J］.Oral Maxillofacial Surge，1999，57（8）：922－929.

［8］ 陳百成，張洪斌，張漢杰，等.生長(zhǎng)因子對(duì)軟骨細(xì)胞的作用［J］.中華骨科雜志，1999，19（12）：746－748.