辛玲歌 張 旋 張媛媛 陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（咸陽(yáng)712000）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）又稱(chēng)退行性關(guān)節(jié)病，是以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為病理特征的疾病，是多見(jiàn)于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。據(jù)調(diào)查，目前骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年增高，卻沒(méi)有較理想的治療手段，因此探尋一種有效、簡(jiǎn)便、安全、經(jīng)濟(jì)的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎治療方法是必要的?！帮L(fēng)濕骨痹口服液”是根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論和長(zhǎng)期實(shí)踐積累，經(jīng)反復(fù)臨床驗(yàn)證總結(jié)出的具有滋補(bǔ)肝腎、活血祛瘀、溫經(jīng)止痛的純中藥復(fù)方制劑。它由杜仲、淫羊藿、黃芪、熟地黃、續(xù)斷、菟絲子、威靈仙、牛膝、丹參等16味中藥材組成。通過(guò)臨床驗(yàn)證，療效確切。為了控制該制劑的質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法（TLC）對(duì)處方中的黃芪、熟地黃、甘草進(jìn)行薄層色譜鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定“風(fēng)濕骨痹口服液”中原兒茶醛的含量并進(jìn)行方法學(xué)考察，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材 料 1.1 藥品 風(fēng)濕骨痹口服液，陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)（批號(hào)：20110505；20110507；20110509）黃芪甲苷對(duì)照品（編號(hào)：110781－200613；供含測(cè)用，由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供）；熟地黃對(duì)照藥材（編號(hào)：121196－200804，由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供）；甘草對(duì)照藥材（編號(hào)：0904－200108，由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供）；原兒茶醛對(duì)照品（編號(hào)：110810－201007，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供），甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 日本日立高效液相色譜儀、L－2455二極管陣列檢測(cè)器、L－2130四元泵、L－2200自動(dòng)進(jìn)樣器、L－2300柱溫箱、L－2000色譜數(shù)據(jù)工作站；日本島津電子天平AUW120D。

2 方 法 2.1 薄層色譜鑒別 2.1.1 黃芪［1，2］取本品20mL，用水飽和的正丁醇提取三次，每次5mL，合并正丁醇液，以1%氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次5mL，棄去洗液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)酉∫掖?mL 使溶解，加在中性氧化鋁柱（100～120目，2g，內(nèi)徑為1～1.5cm）上，用40%乙醇50mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?mL 使溶解，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑為1.2～1.5cm，柱高為12cm），依次用水20mL、40%乙醇30mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）10℃以下放置后的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液（1→10），105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光和紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)；紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪TLC圖（365nm）

2.1.2 熟地黃［1，3］取本品10mL，加水20mL，搖勻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取熟地黃對(duì)照藥材4g，加水50mL，煎煮30min，濾過(guò)，濾液與供試品同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取以上兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2

圖2 熟地黃TLC圖

2.1.3 甘草［1，4］取本品20mL，用乙醚振搖提取2次，每次20mL，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次20mL，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材1g，加水50mL煎煮30min，濾過(guò)，濾液與供試品同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB試驗(yàn)吸取上述兩種溶液各5μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15：1：1：2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 甘草TLC圖

2.2 含量測(cè)定［5］2.2.1 色譜條件 kromasil C18色譜柱（4.6mm×200mm，5μm）；甲醇－水－冰醋酸（10：87：1）為流動(dòng)相；流速1.0mL·min－1；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)278nm。進(jìn)樣量10μL；在上述的色譜條件下原兒茶醛完全達(dá)到基線(xiàn)分離。與鄰峰分離大于1.5，按原兒茶醛峰計(jì)算理論板數(shù)均在3000以上。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)原兒茶醛的紫外線(xiàn)吸引圖譜，原兒茶醛的最大吸引波長(zhǎng)為278nm，故我們選用278nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)研究，在此波長(zhǎng)處測(cè)定雜峰干擾小。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取原兒茶醛對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL 含0.0213mg的溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密量20110505批次風(fēng)濕骨痹口服液20mL，加水20mL，搖勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，用水洗滌2次，每次15mL，棄去水洗液，乙酸乙酯液置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 陰性干擾試驗(yàn) 按處方中各味藥比例稱(chēng)取適量，按工藝及制法制成缺丹參的空白樣品，同供試品溶液制備方法制得空白對(duì)照溶液，進(jìn)樣。結(jié)果空白對(duì)照溶液在與對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相應(yīng)的位置上無(wú)其它色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明其它成份對(duì)原兒茶醛無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4

圖4 風(fēng)濕骨痹口服液高效液相色譜圖

2.2.6 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密吸取對(duì)照品（濃度0.0213mg／mL）2，5，7.5，10，12.5，15μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件注入色譜儀，測(cè)定峰面積。以原兒茶醛峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y＝1998.5X－2350.8，R2＝0.9999，線(xiàn)性范圍42.6μg～319.5μg。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品（產(chǎn)品批號(hào)：20110505）溶液，分別在0、1、4、8、12h注入液相色譜儀測(cè)定一次峰面積，結(jié)果RSD%＝1.67，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（20.3μg·mL－1）溶液各10μL，連續(xù)5次注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD＝0.32%，說(shuō)明儀器的精密度較好。

2.2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 同一批供試品（20110505）6份按正文含量測(cè)定方法測(cè)定，RSD＝0.59%，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性好。

2.2.10 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取原兒茶醛對(duì)照品適量，加入已知含量的樣品（約為測(cè)定方法中樣品的十分之一）中，按正文含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明本方法回收率較好，方法可行。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 樣品測(cè)定 取3批樣品，分別制備樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三批樣品測(cè)定結(jié)果

3 討 論 風(fēng)濕骨痹口服液是由杜仲、淫羊藿、黃芪、熟地黃、續(xù)斷、菟絲子、威靈仙、牛膝、丹參等十六味中藥制成的口服制劑。具有滋補(bǔ)肝腎、活血祛瘀、溫經(jīng)止痛之功效。用于痹癥膝骨性關(guān)節(jié)炎等證的治療。由于本制劑是復(fù)方制劑，藥物多，有效成分復(fù)雜，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制指標(biāo)一直是質(zhì)控中的難點(diǎn)，使其臨床應(yīng)用受到很大限制，為此我們需要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。在研究過(guò)程中，我們對(duì)風(fēng)濕骨痹中十六味藥物進(jìn)行篩選，用薄層色譜法對(duì)黃芪、熟地黃、甘草進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果供試品與對(duì)照品相應(yīng)的位置上有相同的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品無(wú)干擾，方法具有專(zhuān)一性。采用高效液相色譜法測(cè)定口服液中原兒茶醛的含量，分離度好、精密度高、重現(xiàn)性好、陰性無(wú)干擾。因此對(duì)通過(guò)“風(fēng)濕骨痹口服液”中有效物質(zhì)定性鑒別和含量測(cè)定及方法學(xué)考察的研究，說(shuō)明此方法結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可用于“風(fēng)濕骨痹口服液”質(zhì)量的控制。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì)中華人民共和國(guó)藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB.

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