宗雨 李祥翠 張奕 李吉平

糖皮質(zhì)激素可用于治療分泌性中耳炎（OME），而長期使用糖皮質(zhì)激素的副作用較多，故臨床上尚存在爭議，但是短期局部使用糖皮質(zhì)激素可以加速中耳腔內(nèi)積液的吸收，有助于治療分泌性中耳炎、氣壓傷性中耳炎等以中耳積液為主要特征的中耳病變。既往有研究表明糖皮質(zhì)激素可以提高沙鼠中耳黏膜上皮細(xì)胞中的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)［1，2］。地塞米松能誘導(dǎo)上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）mRNA（ENaC－mRNA）表達(dá)和增加ENaC 攝取Na＋的能力［3］。在人ENaC－α的基因序列中發(fā)現(xiàn)有糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件的結(jié)合位點，推測糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的作用是通過直接上調(diào)ENaC的轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)［4］，但是糖皮質(zhì)激素對中耳黏膜上皮細(xì)胞中ENaC的作用尚不清楚。本研究擬采用實時定量－聚合酶鏈反應(yīng)（real time－polymerase chain reaction，RT－PCR）來評估地塞米松對氣壓創(chuàng)傷性中耳炎模型動物中耳黏膜ENaC基因轉(zhuǎn)錄的影響，為進(jìn)一步探討糖皮質(zhì)激素治療OME的機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生5～7周的清潔級健康SD 雄性大鼠18只，體重140～250克，無噪聲暴露和藥物使用史，耳廓反射靈敏，外耳道及鼓膜均無異常，術(shù)前ABR、聲導(dǎo)抗檢查均正常。實驗動物隨機(jī)分為為干預(yù)組、模型組及正常對照組，每組6只（12耳）。

1.2 氣壓創(chuàng)傷性中耳炎動物模型的制作 將模型組及干預(yù)組大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（45 mg／kg）腹腔注射麻醉后置于密閉容器內(nèi)，在50秒內(nèi)改變密閉容器壓力使其高于正常大氣壓4kPa，維持6 分鐘。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)解剖顯微鏡通過鼓膜直接觀察鼓室內(nèi)有積液；②聽性腦干反應(yīng)檢測反應(yīng)閾提高。本實驗中造模成功率為100%。

1.3 各組大鼠的處理 正常對照組未予任何處理，干預(yù)組在造模成功后連續(xù)三天腹腔注射地塞米松（2 mg／kg，加入生理鹽水0.5ml），模型組不用藥。造模后第1、3、7天，分別在戊巴比妥鈉（45mg／kg）腹腔注射麻醉后，經(jīng)解剖顯微鏡觀察各組大鼠的鼓膜征象。干預(yù)組和模型組大鼠均在造模后第七天斷頭處死，取中耳黏膜，正常對照組大鼠直接取中耳黏膜。

1.4 各組大鼠中耳黏膜ENaC轉(zhuǎn)錄的檢測

1.4.1 總RNA 的抽提 造模后第7天將各組大鼠腹腔注射苯巴比妥鈉（70mg／kg）麻醉后，快速斷頭處死，取出聽泡用去RNA 酶處理的器械打開聽泡，在解剖顯微鏡下剝離中耳腔鼓岬，中下鼓室及咽鼓管周圍的黏膜，立即放入去RNA 酶處理的離心管中，液氮保存。由于大鼠中耳黏膜量極少，故以1只大鼠兩耳的中耳黏膜標(biāo)本為一份實驗樣品（n＝6）。應(yīng)用Trizol法抽提各實驗樣本總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.4.2 RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 取5μg總RNA＋1μl寡聚脫氧核苷酸［Oligo（dT）20］＋1μl dNTP（10mol／mL），用焦碳酸二乙酯水補(bǔ)足至總體積10 μl；65 ℃變性5min，立即置于冰上至少1min；加入10μl合成互補(bǔ)DNA 反應(yīng)混合液［（2μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4μl MgCl2（25 mol／L）、2μl DTT（0.1 mol／L）、1μl RNaseOUTTM（40 U／μl）、1μl SuperscriptTMⅢRT（200 U／μl）］，50 ℃50 min 互補(bǔ)DNA 合成；85 ℃50min終止反應(yīng)；加入1μl E.coliRNA 酶H（2U／μl），37 ℃20min酶解殘留的RNA；－20 ℃保存。

1.4.3 RT－PCR 反應(yīng) 應(yīng)用RT－PCR 檢測三組大鼠中耳黏膜α－ENaC、β－ENaC、γ－ENaC 基因轉(zhuǎn)錄的差異：①引物設(shè)計見表1；②PCR 反應(yīng)體系：取100ng 模板互補(bǔ)DNA＋10μl 2×QuantiFast SYBR GREEN PCR Master Mix ＋1μl正向引物（10μmol）＋1μl反向引物（10μmol），用不含RNA酶的水補(bǔ)足至總體積20μl；每個樣本互補(bǔ)DNA 的每個基因做3 個復(fù)孔；③95 ℃變性3 min；40 個PCR 循環(huán)（94 ℃，20秒；59 ℃，20秒；72 ℃，30秒）；72℃延伸5min。PCR 產(chǎn)物與100bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。④將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR 產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8、1×10－9這幾個濃度的DNA；將這幾個梯度稀釋的DNA 模板以及所有的cDNA 樣品分別配置RT－PCR 反應(yīng)體系，置于RT－PCR 反應(yīng)儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；40個循環(huán)（95 ℃，10秒；59 ℃，15秒；72 ℃，20秒；82.5 ℃（收集熒光），5 秒。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72 ℃緩慢升溫至99 ℃（每5秒升高1 ℃），建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，以鑒定產(chǎn)物是否單一。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Real time PCR 反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過7300System Software軟件的分析，計算出樣本中各基因的循環(huán)閾值（CT 值）；CT 值經(jīng)對數(shù)擬合作圖，得到定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)E＝10（－1／slope）計算擴(kuò)增效率，采用管家基因GAPDH（不同樣品間的表達(dá)量基本恒定）作為內(nèi)參來校正，正常對照組大鼠的正常中耳黏膜作為對照，即以正常對照組所得的數(shù)據(jù)為1作為參考，待測樣品基因相對含量＝2－△△CT（△CT＝待測基因CT－管家基因CT）。

表1 Real time－PCR 引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSSl7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠鼓膜形態(tài) 正常對照組大鼠兩耳鼓膜各時間段均未見明顯異常；模型組第1天時每只大鼠至少有一耳可見鼓室內(nèi)充滿琥珀色積液，鼓膜充血，松弛部膨出，可見小氣泡；第3天時鼓室仍有琥珀色積液，以上鼓室為著，松弛部內(nèi)陷，氣泡消失；第7天時未見鼓室積液，鼓膜亦基本恢復(fù)正常。干預(yù)組第1天時每只大鼠至少有一耳可見鼓室內(nèi)充滿琥珀色積液，鼓膜充血，松弛部膨出，可見小氣泡；第3天時所有大鼠兩耳均未見明顯積液征，鼓膜渾濁；第7天時未見鼓室積液，鼓膜亦基本恢復(fù)正常。

2.2 各組大鼠中耳黏膜上皮鈉通道m(xù)RNA 的表達(dá) 干預(yù)組與模型組α－ENaC 基因轉(zhuǎn)錄相對于正常中耳黏膜分別為1.104 8±0.004 8、0.541 8±0.001 3，干預(yù)組相對于模型組上調(diào)2.04 倍（P＜0.01）；干預(yù)組與模型組β－ENaC 基因轉(zhuǎn)錄相對于正常中耳黏膜分別為1.046 0±0.004 3、0.429 9±0.000 9，干預(yù)組相對于模型組轉(zhuǎn)錄增加2.56倍（P＜0.01）；干預(yù)組與模型組γ－ENaC 基因轉(zhuǎn)錄相對于正常中耳黏膜分別為1.022 1±0.001 4、0.510 7±0.000 6，干預(yù)組相對于模型組轉(zhuǎn)錄增加2.00倍（P＜0.01）（圖1）。

圖1 模型組與干預(yù)組中耳黏膜上皮鈉通道m(xù)RNA 表達(dá)干預(yù)組的α－ENaC－mRNA、β－ENaC－mRNA、γ－ENaCmRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，分別為模型組的2.04、2.56、2.00倍

3 討論

體外研究［5～8］表明正常中耳黏膜上皮細(xì)胞存在ENaC 表達(dá)且在積液吸收中起著主導(dǎo)作用，ENaC是貫穿于細(xì)胞膜兩側(cè)的大分子物質(zhì)，其啟閉直接影響細(xì)胞膜兩側(cè)的鈉離子濃度。已有研究表明ENaC分布在各級呼吸道（從鼻咽到細(xì)支氣管）上皮細(xì)胞的腔頂面［9］。在正常狀態(tài)下，ENaC 和Na＋－K＋－ATPase共同調(diào)節(jié)Na＋進(jìn)出細(xì)胞，上皮細(xì)胞通過ENaC 攝取Na＋，然后經(jīng)基底側(cè)表面的Na＋－K＋－ATPase將Na＋泵至組織間隙，在Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)的同時，伴隨著水的被動吸收，從而維持細(xì)胞內(nèi)外的Na＋濃度和液體平衡［10］。Song等［11］進(jìn)一步應(yīng)用共聚焦顯微鏡對比人與豬的呼吸道上皮表面液體（粘液毯）（airway surface liquid ，ASL）厚度，發(fā)現(xiàn)ENaC 在呼吸道黏膜的Na＋和水吸收中起著重要作用。

中耳腔－咽鼓管黏膜纖毛系統(tǒng)的上皮細(xì)胞來源于呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，如同呼吸道上皮細(xì)胞一樣，中耳纖毛在其覆蓋的黏液毯中運(yùn)動，通過纖毛的擺動，將中耳腔內(nèi)的積液通過咽鼓管排至鼻咽部，其電解質(zhì)、水分的成分及量的恒定在維持中耳黏膜的相對干燥狀態(tài)中起重要作用［12］。Choi等［13］通過比較體外培養(yǎng)的中耳黏膜上皮細(xì)胞與鼻黏膜上皮細(xì)胞阿米洛利（amiloride）－敏感的短路循環(huán)電流（amiloride－sensitive Isc）、液體吸收能力、ENaC 的基因轉(zhuǎn)錄及其蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)中耳黏膜上皮細(xì)胞的amiloride－敏感的短路循環(huán)電流及細(xì)胞對液體的吸收能力顯著高于鼻黏膜上皮細(xì)胞，且其ENaC 的基因轉(zhuǎn)錄及其蛋白質(zhì)的表達(dá)一致上調(diào)，進(jìn)一步從分子水平證實中耳黏膜上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)在中耳積液清除中起著重要的作用。前期研究［14，15］報道了大鼠的中耳黏膜能夠通過ENaC介導(dǎo)鈉、水轉(zhuǎn)運(yùn)，證實了ENaC介導(dǎo)的液體吸收在維護(hù)中耳腔的水鈉平衡中起重要作用。

目前認(rèn)為糖皮質(zhì)激素清除中耳腔積液的機(jī)制有以下幾種：①通過抑制炎癥因子的合成發(fā)揮直接抗炎作用；②減輕咽鼓管咽口處黏膜的腫脹，提高咽鼓管的功能；③增加咽鼓管的表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生；④降低粘蛋白的生成，從而降低中耳腔積液的粘度。但近來研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。Tan等［1，2］研究表明ENaC 在中耳腔積液的吸收中起重要作用，且地塞米松能提高沙鼠中耳上皮細(xì)胞鈉離子的吸收［1，2］；Son等［7］研究認(rèn)為地塞米松可通過上調(diào)人正常中耳黏膜上皮細(xì)胞中ENaC－α、β亞基的表達(dá)來增加ENaC介導(dǎo)鈉、水吸收，從而清除中耳腔積液。本研究結(jié)果顯示，地塞米松能加速氣壓創(chuàng)傷性中耳炎SD 模型大鼠中耳腔積液的清除，上調(diào)ENaC 在中耳黏膜中的基因轉(zhuǎn)錄，使ENaC 的α－mRNA、β－mRNA、γ－mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，分別是模型組的2.04 倍、2.56倍、2.00倍，與Dagenais等［3］的研究一致，該研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)α－ENaC、β－ENaC、γ－ENaC的基因轉(zhuǎn)錄，尤以α－ENaC較為顯著。另有研究發(fā)現(xiàn)在牛乳腺細(xì)胞中，地塞米松可以通過上調(diào)β－ENaC，γ－ENaC 基因及蛋白的表達(dá)來降低乳液中鈉離子濃度，該研究認(rèn)為地塞米松是通過上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)來調(diào)控β－ENaC、γ－ENaC的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)［16］。所以地塞米松對不同組織細(xì)胞中ENaC基因轉(zhuǎn)錄的影響可能受個體細(xì)胞株的特性以及局部微環(huán)境的影響，其具體機(jī)制尚不清楚，其分子生物基礎(chǔ)以及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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