解為全 廖華 楊希林 陳抗松 鄒哲飛 李暐

耳鳴是指個體在外界無聲源或電刺激的情況下主觀感覺耳內或者顱內有聲音，是一種常見的臨床癥狀［1］。部分耳鳴患者通過轉移注意力能夠耐受耳鳴，部分耳鳴患者由于持續(xù)、枯燥耳鳴聲嚴重影響學習和生活，甚至出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒障礙。同時，焦慮、抑郁等情緒障礙可以加重患者對耳鳴的主觀感覺，從而形成惡性循環(huán)，給患者帶來極大痛苦［2］。耳鳴產(chǎn)生的機制尚不明確，目前被廣泛認可的理論由Jastreboff［3］提出，他認為耳鳴產(chǎn)生于聽覺皮層下中樞對神經(jīng)末梢的微弱信號的覺察處理過程中，與自主神經(jīng)系統(tǒng)和邊緣系統(tǒng)密切相關。因此，情緒相關腦區(qū)參與耳鳴的發(fā)生、發(fā)展、維持以及耳鳴發(fā)病的心理機制成為耳科學家及心理學家的研究熱點。促腎上腺皮質激素釋放因子（corticotropin－releasing facotr，CRF）作為急慢性應激應答的驅動因子廣泛存在于情緒相關腦區(qū)，與應激、情緒、學習和記憶等行為活動密切相關，可能在耳鳴引起負性情緒和大腦海馬區(qū)對耳鳴的病理性記憶中起重要作用。本研究擬通過檢測水楊酸鈉致耳鳴大鼠模型海馬區(qū)CRF的表達，探討CRF與耳鳴的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康Wistar大鼠30只（購自武漢大學A3動物實驗室），體重200～300g，2～3月齡，耳廓反應靈敏，雌雄不拘，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。隨機分為A、B、C 三組，每組10只，A 組每天注射10%水楊酸鈉溶液（購自Sigma公司）350 mg／kg，共注射21 天；B 組每天注射10%水楊酸鈉溶液350 mg／kg，共注射14 天；C 組為陰性對照組，每天同時間注射等量生理鹽水14天。

1.2 動物耳鳴行為學檢測 大鼠耳鳴行為學檢測最經(jīng)典的方法是Jastreboff提出的飲水抑制法［4］，本實驗參考Jastreboff經(jīng)典飲水抑制法并在此基礎上將足部電擊改為嘴部電擊。在水楊酸鈉注射前采用飲水抑制法對三組大鼠進行條件反射訓練，使大鼠形成“聲音出現(xiàn)－飲水開始，聲音消失－飲水停止”的條件反射，條件反射建立后停止訓練并開始注射水楊酸鈉，條件反射消退期1～3天測量飲水抑制率（R），R＝B／（A＋B），其中B 為條件刺激（背景噪聲停止）期1min內大鼠的飲水次數(shù)，A 為條件刺激之后1min內大鼠飲水次數(shù)。

1.3 ABR 檢測 分別于給藥前、首次給藥后2h、給藥結束當天對各組大鼠行ABR 檢測。檢測均在環(huán)境噪聲＜30dB SPL 的隔聲屏蔽室中進行，動物腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg／kg麻醉，記錄電極置于顱頂正中位置，參考電極置于同側耳后皮下，鼻尖接地。探測音由SigGenRP2（TDT）軟件包編譯，TDT（Tucker－Davis Technology）系統(tǒng)校準后連接高頻電磁揚聲器（MF1）給聲，采用BioSigRP2（TDT）軟件包記錄分析結果。采用短聲（click）刺激，極間電阻＜5kΩ，刺激率為21次／秒，觀察時程10ms，濾波帶寬100～3 000 Hz，疊加500次，以引出波Ⅲ的最小刺激強度為反應閾。

1.4 Western blot檢測大鼠腦海馬區(qū)CRF表達 給藥結束當天各組動物處死后斷頭取腦，根據(jù)George Paxinos ＆Charles Watson大鼠立體定位圖譜［5］定位大鼠腦海馬區(qū)，體式顯微鏡下掀開大腦皮層后迅速完整剝離海馬，整個取材過程冰上操作，取材后將組織置于－80 ℃冰箱保存。各組標本分別稱重，加入適量RIPA 裂解液后冰上勻漿，4 ℃12 000rpm 離心，取上清液，BCA 法測蛋白濃度，各樣品取50μg總蛋白上樣，恒壓120V／40mA，12%的SDS－PAGE凝膠電泳。根據(jù)預染溴酚藍顯示，目的蛋白充分分離后，停止電泳。取出凝膠，切下目的條帶，蒸餾水沖洗后200 mA 恒流PVDF 膜轉膜，用含5% 含脫脂奶粉的TBST 封閉液室溫封閉2 h，將PVDF 膜浸泡于含兔抗鼠GAPDH 及兔抗鼠CRF一抗孵育液（1：500，Santa）中，4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜5min×5次，加入HRP 標記二抗（1：40 000，武漢博士德生物公司），室溫搖床孵育2h。TBST 洗膜5min×5次，ECL 發(fā)光劑曝光、顯影，Gel Pro4.0 軟件進行灰度掃描分析，檢測條帶光密度比值（CRF／GAPDH），比較各組CRF 蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)總體差異采用單因素方差分析（One－way analysis of variance，One－Way ANOVA），組間多重比較采用LSD－t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學檢測結果 經(jīng)過5天的適應性訓練三組大鼠飲水抑制率均小于0.2，且R 值趨于穩(wěn)定，大鼠條件反射已經(jīng)建立。條件反射消退期1～3天A、B 兩組大鼠R 值大于C 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明耳鳴大鼠模型造模成功。從第4天開始，三組大鼠R 值差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 ABR 檢測結果 給藥前各組大鼠ABR 反應閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。A、B兩組大鼠水楊酸鈉注射后2hABR 波形分化較差，反應閾較注藥前和對照組明顯升高（P＜0.01）；對照組大鼠ABR 反應閾與注射前差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥結束后當天，A、B 兩組大鼠ABR 反應閾較首次給藥后2小時升高（P＜0.05），較對照組也明顯提高（P＜0.01），但A、B 兩組間ABR 反應閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠不同時間ABR 反應閾比較（dB SPL，±s）（n＝20耳）

表1 各組大鼠不同時間ABR 反應閾比較（dB SPL，±s）（n＝20耳）

注：＊與同組給藥前及對照組同一時間比較，P＜0.01；△與同組給藥后2h比較，P＜0.05

組別給藥前首次給藥后2h 給藥結束后A 組30.0±2.8 57.8±3.4＊61.7±3.6△＊B組30.2±2.2 58.9±4.4＊60.2±3.1△＊C組30.9±2.6 29.5±2.5 30.2±2.0

2.3 各組大鼠海馬區(qū)CRF 表達 給藥結束后A、B、C三組CRF／GAPDH 的值分別為0.25、0.23和0.09，可見A 組大鼠海馬區(qū)CRF表達最高，B 組次之，C 組表達最低，A、B 兩組與C 組大鼠海馬區(qū)CRF表達差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖1）。

圖1 Western blot法檢測三組大鼠腦海馬區(qū)CRF表達

3 討論

海馬不僅是邊緣系統(tǒng)的重要結構，也是下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸的高級調節(jié)中樞之一，在應激反應的調控中起到重要作用，與學習記憶、情緒調節(jié)等行為活動密切相關［6］。CRF 是由41個氨基酸組成的多肽，由下丘腦室旁核（PVN）分泌，能夠刺激垂體前葉皮質釋放大量促腎上腺皮質激素，被認為是應激反應調節(jié)的驅動因子［7］。研究表明CRF 不僅存在于PVN，而且廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它區(qū)域如新皮質、腦干和邊緣系統(tǒng)（杏仁核、海馬）。在海馬，CRF 能夠增強海馬椎體細胞興奮性，促進長時程增強（LTP）的誘導和形成，影響神經(jīng)突觸的結構和數(shù)目，在學習記憶、情緒反應以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［8］。急性應激和慢性溫和不可預知應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）動物模型可導致海馬對下丘腦抑制減弱，迅速合成的CRF激活HPA 軸調節(jié)機體應激反應。長時間的過度刺激可以持續(xù)興奮HPA 軸，促進海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質的釋放，使突觸后膜NMDA 受體增敏，形成病理性LTP，參與病理性及創(chuàng)傷性記憶的形成和鞏固［9］。同時，如果海馬受到高水平糖皮質激素及興奮性神經(jīng)遞質的損傷，可導致神經(jīng)信息傳遞損害，引起學習、記憶、情緒障礙。

海馬和杏仁核是邊緣系統(tǒng)兩個主要的腦區(qū)，Mirz等［10］發(fā)現(xiàn)耳鳴患者的杏仁核及海馬的腦血流明顯增加，活性增強，提示邊緣系統(tǒng)參與了耳鳴的發(fā)病機理；O’Mara等［11］發(fā)現(xiàn)適當?shù)穆曇舸碳た梢源龠M聽覺中樞系統(tǒng)和邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)育；海馬和杏仁核接受來自聽覺中樞的神經(jīng)纖維投射，同時海馬和杏仁核也直接或者間接投射纖維到聽皮層已經(jīng)得到證實［12］。本研究發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉注射14天后大鼠海馬區(qū)CRF明顯上升，說明長期的耳鳴刺激可以持續(xù)興奮大鼠情緒相關腦區(qū)，并對大鼠海馬病理性記憶產(chǎn)生了影響；水楊酸鈉注射21天后CRF 表達繼續(xù)升高，一方面可能是使病理性記憶得到鞏固，另一方面可能通過多種機制損傷了海馬神經(jīng)元，參與了抑郁、焦慮情緒的發(fā)生。另外在耳蝸發(fā)現(xiàn)了局部類似HPA 軸的控制系統(tǒng)，CRF1基因敲除大鼠產(chǎn)生聽力損失，其具體機制尚不清楚，說明CRF 在聽覺形成中起到重要作用［13］，因此CRF 表達升高，可能在邊緣系統(tǒng)與聽覺中樞系統(tǒng)的復雜神經(jīng)纖維投射中起到橋梁作用。

水楊酸鈉致耳鳴動物模型是最常用的耳鳴動物模型，其外周及聽覺中樞機制已得到廣泛的研究［14］。經(jīng)典的飲水抑制法和近年來興起的驚跳反射前抑制（prepules inhibition of acoustic startle response，PPI）［15］等動物行為學模型均證實了350 mg／kg水楊酸鈉鈉溶液連續(xù)注射可以使動物產(chǎn)生持續(xù)2～3天的耳鳴。本實驗將經(jīng)典的飲水抑制法進行改進，同樣發(fā)現(xiàn)大鼠條件反射消退期1～3 天A、B兩組與C組大鼠飲水抑制率（R 值）存在差異，證實了水楊酸鈉可以使大鼠產(chǎn)生耳鳴，成功建立了水楊酸鈉致耳鳴大鼠模型。從文中結果看，水楊酸鈉注射2h后A、B兩組大鼠ABR 反應閾發(fā)生了約30dB的閾移，與文獻報道一致［16］，水楊酸鈉注射14天組與21天組大鼠ABR 反應閾變化不大，可能是水楊酸鈉對聽覺系統(tǒng)的作用達到飽和，也可能是大鼠對耳鳴的一種適應。

總之，CRF 作為情緒應激相關蛋白，可能與邊緣系統(tǒng)參與水楊酸鈉致耳鳴的發(fā)生、發(fā)展和維持的機制相關，在耳鳴的精神心理機制中起到了重要作用，說明長期慢性耳鳴刺激可能通過精神心理因素加重耳鳴病情。

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