趙志英，朱宏謙，張 璇，劉 麗，張國(guó)紅

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，教育部血管與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省新藥藥理毒理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017;2.河北省公安廳國(guó)內(nèi)安全保衛(wèi)總隊(duì)，河北石家莊 050051)

內(nèi)向整流鉀通道 (inwardly rectifying potassium channel，Kir)的特征是鉀離子容易由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的電壓依賴(lài)性?xún)?nèi)向整流特性，這種通道的整流作用有利于維持細(xì)胞的靜息電位并參與復(fù)極化過(guò)程［1］。Kir通道至少由7個(gè)家族組成，它們?cè)诟鞣N組織中廣泛分布，Kir2.0家族是它的重要一員，主要存在于心臟、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌等許多組織。Kir2.1和Kir2.3是Kir2.0家族中的重要成員，在心臟，Kir2.1和Kir2.3是心臟內(nèi)向整流鉀電流的重要組成部分，對(duì)維持心肌細(xì)胞動(dòng)作電位起重要作用;在腎臟，Kir2.1和Kir2.3是腎皮質(zhì)集合管內(nèi)向整流鉀電流的重要組成部分，對(duì)維持腎臟的泌鉀、濾過(guò)重吸收等生理功能起重要作用。Kir2.1鉀通道是目前Kir2.0家族中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)與離子通道病有關(guān)的通道。編碼Kir2.1鉀通道的基因突變，將會(huì)引起安德森綜合征(Andersen’s syndrome，AS)，典型的臨床表現(xiàn)為周期性麻痹、室性心動(dòng)過(guò)速性心律失常和明顯的結(jié)構(gòu)異常［2］。研究Kir2.1和Kir2.3的調(diào)控機(jī)制對(duì)研究整個(gè)內(nèi)向整流鉀通道家族的調(diào)控機(jī)制有重要意義［3］。在研究過(guò)程中人們發(fā)現(xiàn)Kir2.3可以被細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的許多信號(hào)分子如Mg2+、多胺、H+、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)、花生四烯酸、植物雌激素、ATP等所調(diào)控［4－6］，而這些調(diào)控因素都對(duì) Kir2.1沒(méi)有作用或作用很弱，因此我們?cè)O(shè)想構(gòu)建不同的Kir2.1和Kir2.3通道嵌合體，為進(jìn)一步研究Kir2.3的調(diào)控機(jī)制和通道特異性阻斷劑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Kir2.3，Kir2.1的cDNA克隆在質(zhì)粒pGEMHE中。pGEMHE質(zhì)粒DNA由美國(guó)紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系Diomedes Logothetis教授饋贈(zèng)。Pyrobest DNA polymerase、EcoRI、BamHI等限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司?；驍U(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Biometra公司，Nanoliter Injector RNA注射儀購(gòu)自美國(guó)WPI公司，Geneclamp 500B放大器購(gòu)自美國(guó)Axon公司。

1.2 方法

1.2.1 嵌合體構(gòu)建 以 N1P3C3為例說(shuō)明 Kir2.1/Kir2.3嵌合體構(gòu)建過(guò)程。將Kir2.3通道的氨基末端替換為Kir2.1通道的氨基末端，根據(jù)GenBank發(fā)表的Kir2.1和Kir2.3通道的序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增Kir2.1通道氨基末端的引物和擴(kuò)增Kir2.3通道孔區(qū)、跨膜區(qū)、羧基末端的引物。Kir2.1-N上游引物包含一個(gè) BamHI酶切位點(diǎn)為:5'-CGGGGATCCATGGGCAGTGTGAGAACC-3';下游引物為:5'-GAGACAAGGAAGGCCGCGGAGAAGATAACCAGCATCCACC-3';以 Kir2.1-pGEMHE質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，25 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。Kir2.3-PC上游引物為:5'-GTGGATGCTGGTTATCTTC TCCGCGGCCTTCCTTGTCTCC-3';下游引物包含一個(gè) EcoRI酶切位點(diǎn)為:5'-GATGAATTCGATCCGGGGACCTAGAGAGCCAC-3';以Kir2.3-pGEMHE質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，切膠純化，并作為模板進(jìn)行重疊延伸PCR，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，8 個(gè)循環(huán);72℃延伸 10 min。再加入 Kir2.1-N上游引物和Kir2.3-PC下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性 5 min;94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，25 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后與pGEMHE質(zhì)粒DNA進(jìn)行 EcoRI和 BamHI雙酶切，酶切后進(jìn)行純化，在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)菌增菌，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，送基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析，挑選沒(méi)有突變的克隆，命名為N1P3C3。采用同樣的方法構(gòu)建其它的嵌合體質(zhì)粒。

1.2.2 嵌合體通道表達(dá) 嵌合體通道質(zhì)粒DNA用限制性核酸內(nèi)切酶NheI將其線性化，采用RibomaxTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit試劑盒體外轉(zhuǎn)錄得到cRNA。分離爪蟾卵母細(xì)胞，將cRNA注入爪蟾卵母細(xì)胞，在18℃培養(yǎng)1－2天后，用雙電極電壓鉗記錄電流是否表達(dá)。灌流液 ND96(mmol·L－1):NaCl 96，KCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用 NaOH 調(diào) pH 為7.4;ND96K(mmol·L－1):KCl 96，NaCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用 KOH 調(diào) pH為7.4。

1.2.3 記錄電流 室溫下(22℃ ～24℃)記錄電流，放大器Mode設(shè)為SETUP狀態(tài)。按下按鈕Zero V1和Zero V2使兩電極電位顯示為零，用R1和R2測(cè)量電極電阻。刺入電極，將放大器Mode調(diào)為Voltage clamp狀態(tài)，記錄通道電流。信號(hào)的采集和分析軟件為pClamp 9.0。實(shí)驗(yàn)所用protocol為:先將膜電位鉗制在0mV，然后從－90 mV逐漸增加(ramp)到+90 mV。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 Clampfit 9.0(美國(guó)Axon公司)和OriginPro 7.0(美國(guó)Origin Lab公司)，Adobe Illustrator 10等軟件進(jìn)行圖像處理及數(shù)據(jù)分析。

Fig 1 Construction of Kir2.1/Kir2.3 chimeras by over-lap extension PCR

2 結(jié)果

2.1 嵌合體構(gòu)建 由于Kir2.1和Kir2.3通道都屬于同一個(gè)Kir2.0亞家族，他們的氨基酸序列具有58%的同源性，因此構(gòu)建Kir2.1和Kir2.3通道的嵌合體產(chǎn)生功能性通道的可能性很大。根據(jù)已知的Kir通道結(jié)構(gòu)，他們以一個(gè)較短的氨基末端(N)在細(xì)胞內(nèi)起始，經(jīng)過(guò)兩次跨膜折疊(M1，M2)后，以一個(gè)較長(zhǎng)的羧基末端(C)在細(xì)胞內(nèi)終止［7］。構(gòu)建嵌合體通道時(shí)首先考慮將通道的氨基和羧基末端進(jìn)行互換。通道命名原則如下:數(shù)字1和3分別代表Kir2.1和Kir2.3通道，字母N代表氨基末端，字母C代表羧基末端，字母P代表兩個(gè)跨膜區(qū)和孔區(qū)。我們首先構(gòu)建一個(gè)嵌合體通道N1P3C3，即通道的氨基末端來(lái)源于Kir2.1通道，通道的兩個(gè)跨膜區(qū)和孔區(qū)、羧基末端來(lái)源于Kir2.3通道。以Kir2.1質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增出Kir2.1通道氨基末端，以Kir2.3質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增出Kir2.3通道跨膜區(qū)和孔區(qū)、羧基末端，經(jīng)重疊延伸PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物為N1P3C3，產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 450 bp，經(jīng)過(guò)膠回收，雙酶切純化后與pGEMHE載體DNA連接，得到N1P3C3-pGEMHE，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，挑選沒(méi)有堿基突變的克隆。至此，嵌合體通道N1P3C3構(gòu)建成功(Fig 1 A)。以類(lèi)似的方法分別將通道的氨基末端、羧基末端、跨膜區(qū)和孔區(qū)進(jìn)行互換，成功構(gòu)建 N3P1C1，N3P3C1，N1P1C3，NIP3C1，N3P1C3 等幾個(gè)嵌合體通道。N1P3C3和N3P1C1是將通道的氨基末端進(jìn)行了互換，N1P3C3是指通道的氨基末端來(lái)源于Kir2.1通道，通道的兩個(gè)跨膜區(qū)和孔區(qū)、羧基末端來(lái)源于Kir2.3通道;N3P1C1是指通道的氨基末端來(lái)源于Kir2.3通道，通道的兩個(gè)跨膜區(qū)和孔區(qū)、羧基末端來(lái)源于 Kir2.1通道。N3P3C1和N1P1C3是將通道的羧基末端進(jìn)行了互換。NIP3C1和N3P1C3是將通道的氨基末端和羧基末端同時(shí)進(jìn)行了互換(Fig 1 B)。

2.2 電壓鉗記錄嵌合體電流 將嵌合體通道N1P3C3表達(dá)于卵母細(xì)胞，雙電極電壓鉗記錄電流，觀察電流特征。灌流液為ND96K(在此溶液所記錄到的內(nèi)向電流最大)，鉗制電壓為由－90 mV漸變成+90 mV，根據(jù)電流隨電壓的變化可得到N1P3C3通道的電壓電流關(guān)系曲線，橫坐標(biāo)上方的電流為外向電流，橫坐標(biāo)下方的電流為內(nèi)向電流(Fig 2)。由Fig 2可以看出N1P3C3通道的內(nèi)向電流明顯大于外向電流，且內(nèi)向電流與電壓有明顯的線性關(guān)系，而外向電流則沒(méi)有這種線性關(guān)系，反轉(zhuǎn)電位在ND96K灌流情況下為0 mV左右。Ba2+是鉀通道的阻斷劑，用含 0.3 mmol·L－1BaCl2的ND96K灌流N1P3C3通道。為了更清楚地觀察電流，我們選取觀察高鉀情況下電流幅度較大的－80 mV時(shí)的電流，+80 mV的電流為對(duì)照，結(jié)果顯示Ba2+能夠有效抑制N1P3C3的電流(Fig 3)。這些結(jié)果表明N1P3C3的電流特征沒(méi)有改變，符合內(nèi)向整流鉀通道的電流特征。將其它嵌合體通道N3P1C1，N3P3C1，N1P1C3，NIP3C1，N3P1C3 同樣表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，記錄電流，得到了相同的結(jié)果，嵌合體通道的電流特性均未改變(結(jié)果未顯示)。

Fig 2 Current-voltage relationship of Kir2.3 currents in high-K+solution(ND96K)

3 討論

內(nèi)向整流鉀通道在各種組織廣泛分布，其電流特征為鉀離子流入細(xì)胞內(nèi)遠(yuǎn)比流出細(xì)胞外容易。Kir通道是由4個(gè)同源或異源亞基組成的四聚體，每個(gè)亞基都是由氨基末端、孔區(qū)和跨膜區(qū)、羧基末端組成，結(jié)構(gòu)相似，因此構(gòu)建Kir2.1和Kir2.3的嵌合體通道可行性很高，產(chǎn)生功能性通道的幾率很大［7］。

Fig 3 Whole-cell Kir2.3 currents recorded by two electrodes voltage clamp(TEVC)

Kir2.1和Kir2.3是Kir2.0家族重要成員，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等許多組織都有分布，起著重要的生理作用，許多調(diào)控因子對(duì)他們都有調(diào)節(jié)作用。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控因子對(duì)Kir2.1和Kir2.3調(diào)控作用大相徑庭。PIP2是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要分子［8］，PIP2水解使Kir2.3通道電流明顯下降，對(duì)Kir2.1通道電流影響不大，但PIP2抑制Kir2.3通道電流的具體機(jī)制尚不明確;共同表達(dá)Kir2.3通道蛋白與Gβγ亞單位于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)Gβγ亞單位能夠完全抑制Kir2.3通道電流，而對(duì)Kir2.1通道電流卻沒(méi)有作用［9］;氫離子在Kir2.3的門(mén)控機(jī)制中起重要作用，高CO2和低pH值抑制Kir2.3通道電流，對(duì)Kir2.1沒(méi)有作用;在非洲爪蟾卵母細(xì)胞，PKC的激活劑佛波醇酯(PMA)明顯抑制Kir2.3通道電流，對(duì)Kir2.1沒(méi)有作用［4］;花生四烯酸是一種多不飽和脂肪酸，能夠明顯且可逆地增大在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢上皮細(xì)胞表達(dá)的Kir2.3通道電流，對(duì)Kir2.1沒(méi)有作用［6］;如此可見(jiàn)，許多調(diào)控因子對(duì)Kir2.3通道電流都有作用，對(duì)Kir2.1通道電流沒(méi)有作用或作用較弱。Kir2.1和Kir2.3通道同源性很高，而我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將通道的氨基末端、羧基末端、孔區(qū)和跨膜區(qū)進(jìn)行互換，構(gòu)建的嵌合體通道都產(chǎn)生了功能，電流特性沒(méi)有發(fā)生改變，這為以后進(jìn)一步研究調(diào)控因子對(duì)Kir2.1和Kir2.3通道的作用，確定通道與調(diào)控因子的作用位點(diǎn)打下了基礎(chǔ)。先將調(diào)控因子作用于嵌合體通道，分析通道的氨基、羧基、孔區(qū)和跨膜區(qū)哪些片段與調(diào)控因子對(duì)通道的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，在此基礎(chǔ)上分析這些片段上哪些位點(diǎn)的氨基酸是調(diào)控因子作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。

我們對(duì)于Kir2.0通道功能的了解主要通過(guò)研究人類(lèi)疾病引起的通道變化、基因敲除小鼠等。由于一直沒(méi)有通道特異性阻斷劑，不同亞型Kir2.0通道的研究進(jìn)展受到了很大限制。已有報(bào)道編碼Kir2.1鉀通道的基因突變引起安德森綜合征。但是Kir2.1鉀通道是目前Kir2.0亞家族中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)與離子通道病有關(guān)的通道，目前還沒(méi)有關(guān)于編碼Kir2.3鉀通道的基因突變引起臨床疾病的報(bào)道。因此通道特異性阻斷劑的研發(fā)必將會(huì)成為Kir2.0家族通道生理功能研究、藥物特性研究的里程碑事件。然而，到目前為止，Kir2.0通道的阻斷劑僅限于鋇離子、銫離子，許多非特異性藥物比如:植物雌激素、抗組胺藥、卡維地洛、抗瘧藥甲氟喹、鹽酸米帕林［5，10－13］等都可以明顯抑制 Kir2.3 通道電流，對(duì)Kir2.1沒(méi)有作用或作用較弱。因此我們可以通過(guò)構(gòu)建Kir2.1和Kir2.3通道的嵌合體，在上述藥物對(duì)Kir2.3通道電流特異性抑制作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究藥物對(duì)Kir2.3通道的作用機(jī)制，找到它們的作用位點(diǎn)，進(jìn)而為下一步找到通道的特異性阻斷劑，研究通道的生理病理意義打下基礎(chǔ)。

一些內(nèi)向整流鉀通道功能改變可能引起某些非遺傳性病理生理變化比如房顫［14，15］。由于Kir2.1和Kir2.3的廣泛分布及其在神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等的電生理活動(dòng)中起重要作用，進(jìn)一步明確Kir2.1和Kir2.3的功能，了解與通道偶聯(lián)的受體、第二信使及其他信號(hào)分子對(duì)Kir2.1和Kir2.3的調(diào)控，研究 Kir2.1和 Kir2.3通道的特異性阻斷劑十分重要［15］。而本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的Kir2.1和Kir2.3通道的嵌合體為此打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］Guo D，Ramu Y，Klem A M，Lu Z.Mechanism of Rectification in inward rectifier K+Channels［J］.J General Physiol，2003，121(4):261－775.

［2］何海燕，尹永強(qiáng)，李宏杰，等.?；撬徭V對(duì)缺氧/復(fù)氧致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道異常的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(12):1751－6.

［2］He H Y，Yin Y Q，Li H J，et al.Effects of taurine magnesium coordination compound on abnormal inward rectifier potassium channel current induced by hypoxia reoxygenation in cardiomyocytes of rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(12):1751－6.

［3］Kulzer M，Seyler C，Welke F，et al.Inhibition of cardiac Kir2.1-2.3 channels by beta3 adrenoreceptor antagonist SR 59230A［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，424(2):315－20.

［4］杜肖娜，何宏濤，王 川，張海林.PKC對(duì)兩種表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)向整流性鉀通道調(diào)節(jié)的不同及機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(12):1615－9.

［4］Du X N，He H T，Wang C，Zhang H L.Study of the mechanism of different regulation of Kir current in two expressions systems by PKC［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(12):1615－ 9.

［5］Zhao Z Y，Liu B Y，Zhang G H，et al.Molecular basis for genistein-induced inhibition of Kir2.3 currents［J］.Pflugers Arch-Eur J Physiol，2008，456(2):413－23.

［6］Wang C，Mirshahi U L，Liu B Y，et al.Arachdonic acid activates Kir2.3 channels by enhancing channel-PIP2 interactions［J］.Mol Pharmacol，2008，73(4):1185－94.

［7］Hibino H，Inanobe A，F(xiàn)urutani K，et al.Inwardly rectifying potassium channels:their structure，function，and physiological roles［J］.Physiol Rev，2010，90(1):291－366.

［8］陳興娟，張熙東，張 璇，等.蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4，5二磷酸之間相互調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(11):1497－9.

［8］Chen X J，Zhang X D，Zhang X，et al.Progress in the research of mutual regulation between PKC and PI(4，5)P2［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(11):1497－9.

［9］Cohen N A，Sha Q，Makhina E N，Inhibition of an inward rectifier potassium channel(Kir2.3)by G-protein betagamma subunits［J］.J Biol Chem，1996，271(50):32301－5.

［10］Liu B Y，Jia Z F，Geng X，et al.Selective inhibition of Kir currents by antihistamines［J］.Eur J Pharmacol，2007，558(1－ 3):21－6.

［11］Ferrer T，Ponce-Balbuena D，Lopez-Izquierdo A，et al.Carvedilol inhibits Kir2.3 channels by interference with PIP2-channel interaction［J］.Eur J Pharmacol，2011，668(1－2):72－7.

［12］Lopez-Izquierdo A，Ponce-Balbuena D，Moreno-Galindo E G，et al.The antimalarial drug mefloquine inhibits cardiac inward rectifier K+channels:evidence for interference in PIP2-channel interaction［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，57(4):407－15.

［13］López-Izquierdo A，Aréchiga-Figueroa I A，Moreno-Galindo E G.Mechanisms for Kir channel inhibition by quinacrine:acute pore block of Kir2.x channels and interference in PIP2 interaction with Kir2.x and Kir6.2 channels［J］.Pflugers Arch，2011，462(4):505－17.

［14］Ehrlich J R.Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy［J］.Cardio-vasc Pharmaco，2008，52(2):129－35.

［15］De Boer T P，Houtman M J，Compier M，et al.The mammalian K(IR)2.x inward rectifier ion channel family:expression pattern and pathophysiology［J］.Acta Physiol(Oxf)，2010，199(3):243－56.