張自力，張 涉，郭 瑤，王妤清，倪雯霞，張 衍，孔德松，鄭仕中，3

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、2.中藥學(xué)一級(jí)學(xué)科;3.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023)

肝纖維化(hepatic Fibrosis，HF)是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，也是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。肝纖維化發(fā)生時(shí)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)異?；罨鲋?，并合成與分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，最終導(dǎo)致ECM的過度沉積［1－2］。抑制 HSCs增殖、促進(jìn)其凋亡已然成為當(dāng)前抗肝纖維化治療的主要策略［3－4］。

內(nèi)源性大麻素及其受體—大麻素受體1(cannabinoid receptor type 1，CBR1)和大麻素受體2(cannabinoid receptor type 2，CBR2)共同構(gòu)成了內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)。最近的研究表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與急性與慢性肝病以及如肝性腦病等引起的并發(fā)癥改善與恢復(fù)過程，并被認(rèn)為可能是抗肝纖維化的潛在治療靶點(diǎn)［5－6］。姜黃素(Curcumin)是姜黃屬(Curcuma L.)植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然活性成分，用于疾病的治療已經(jīng)有悠久的歷史。隨著研究的深入，姜黃素治療肝纖維化及其作用機(jī)制的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［7］。那么大麻素受體在姜黃素治療肝纖維化的過程中扮演何種角色，目前尚未見諸報(bào)端，我們對(duì)其進(jìn)行了深入的探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SPF級(jí)♂ SD大鼠若干只(上海斯萊克公司，SCXK(滬)2011-0005)，姜黃素(SIGMA，No.045K0933，含量≧99.8%)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，小牛血清(Gibico)，BCA試劑盒(Pierce)，MTT(Promega)，一抗 MAPK(ERK，p-ERK，JNK，p-JNK，p38，p-p38，Cell Signaling)，CBR1和 CBR2(Bioword)，α1(I)collagen和 Fibronectin(Epitomics)，β-actin(Sigma);FITC 綠色熒光二抗(武漢博士德)。恒溫水浴槽(成都儀器廠，型號(hào)HSS-1B)，恒流泵(上海青浦滬西儀器廠，型號(hào)HL-2)，全自動(dòng)高壓滅菌鍋(SANYO，型號(hào) MLS-3020)，萊卡倒置熒光顯微鏡 (德國萊卡公司，型號(hào)DM1L)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司，型號(hào)Nu-6511)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(FORMA，型號(hào)3111)，純水儀(Spring，型號(hào) S/N020579)，核酸蛋白分析儀(BECKMAN，型號(hào)DU640)，電泳槽(Bio-Rad，型號(hào)525BR027843)。

1.2 原代大鼠HSCs的分離與培養(yǎng) 按照改良的原代酶消化循環(huán)灌流法［8］，Nycodenze密度梯度離心分離提取大鼠原代HSCs，將分離的HSCs進(jìn)行通過使用DMEM重懸的方法進(jìn)行簡單的分離、純化，然后采用含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的原代細(xì)胞，傳代4～8代用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)的藥物與刺激物，空白對(duì)照則加入DMEM做為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批且符合科技部有關(guān)善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)定。

1.3 MTT檢測 傳代的HSCs調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后接種于96孔板，每孔 180 μl，1×104個(gè)/孔。置37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后除對(duì)照組外各組分別加入相應(yīng)濃度的CBR1與CBR2激動(dòng)劑與拮抗劑進(jìn)行干預(yù)處理24 h，每組6個(gè)復(fù)孔。作用時(shí)間結(jié)束后加入5μg·L－1MTT 溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除上清，每孔加入200 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的OD值。評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。

1.4 Western blot檢測 HSCs經(jīng)藥物干預(yù)處理后，用冰冷的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解，收集細(xì)胞裂解物，－80℃儲(chǔ)藏過夜。蛋白混合液融化，于4 ℃、12 000 r·min－1下離心15 min，吸取上清 BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，NC轉(zhuǎn)膜，非特異性封閉;加入相應(yīng)一抗，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交。加入ECL發(fā)光劑1 ml，曝光、顯影、定影，灰度掃描以定量。

1.5 細(xì)胞免疫熒光分析 將HSCs接種多聚賴氨酸包被載玻片，培養(yǎng)細(xì)胞至60% ～80%融合率，藥物干預(yù)處理24 h后，固定、洗滌、封閉，以兔抗CBR1抗體(1∶200，Bioword)，4℃孵育過夜，空白對(duì)照以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)孵育過夜。PBS洗3遍，以羊抗兔(1∶60，武漢博士德)FITC標(biāo)記的熒光二抗孵育1 h，PBS洗3遍后，進(jìn)行Hochest染色以標(biāo)記細(xì)胞核。熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 CBR1、CBR2受體激動(dòng)劑與拮抗劑對(duì) HSCs增殖活性的影響 應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)探討CBR1激動(dòng)劑(NADA)與拮抗劑(AM251)，CBR2激動(dòng)劑(JWH015)與拮抗劑(AM630)的對(duì)HSCs增殖的作用效果。結(jié)果表明激動(dòng)CBR1可促進(jìn)HSCs的增殖，相反拮抗CBR1后則可以抑制HSCs的增殖(P＜0.05)。同時(shí)激動(dòng)CBR2也可抑制HSCs的增殖(P＜0.05)，但抑制CBR2時(shí)對(duì)HSCs的增殖就沒有明顯的影響(P＞0.05)(Fig 1)。由此可見大麻素受體在HSCs的增殖活化中具有重要作用。

2.2 CBR1受體拮抗劑對(duì)HSCs中MAPK信號(hào)通路的影響 CBR1與CBR2在HSCs中都有表達(dá)，但CBR1在HSCs活化與增殖中起主要調(diào)控作用，而CBR2主要分布在免疫細(xì)胞中［9］。因此，我們應(yīng)用CBR1拮抗劑AM251作用于HSCs，觀察其對(duì)HSCs中MAPK信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明，CBR1拮抗劑能夠明顯抑制ERK與JNK的磷酸化，并呈劑量依賴性的關(guān)系(P＜0.05)，但對(duì)P38蛋白的表達(dá)沒有什么影響(P＞0.05)。

2.3 姜黃素對(duì)CBR1與CBR2蛋白表達(dá)的影響我們的前期研究證實(shí)姜黃素在體內(nèi)外對(duì)肝纖維化具有明顯的治療效果，可上調(diào)HSCs中的PPARγ，抑制TGF-β信號(hào)通路［10］。本次實(shí)驗(yàn)我們又通過Western bolt與細(xì)胞免疫熒光檢測了姜黃素對(duì)HSCs中兩種類型大麻素受體CBR1與CBR2蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明姜黃素可抑制HSCs中CBR1的表達(dá)(P＜0.05)，但對(duì)CBR2的蛋白表達(dá)沒有明顯的影響(P＞0.05)。

2.4 姜黃素對(duì)CBR1激動(dòng)劑與拮抗劑的刺激下HSCs表達(dá)ECM成分α1(I)collagen和Fibronectin的影響 為進(jìn)一步研究大麻素受體信號(hào)通路在姜黃素抑制HSCs活化增殖中的作用。我們分別加入CBR1的激動(dòng)劑NADA與拮抗劑AM251，觀察姜黃素對(duì)HSCs表達(dá)ECM成分α1(I)collagen和Fibronectin的影響。結(jié)果表明姜黃素可呈劑量依賴性的抑制CBR1激動(dòng)劑導(dǎo)致的ECM成分表達(dá)的上升，并可協(xié)同CBR1拮抗劑抑制HSCs表達(dá)ECM成分的作用(P＜0.05，P＜0.01)。

Fig 1 Cell proliferation detection

Fig 2Inhibitory effects of CBR1 antagonist AM251 on MAPK pathway in HSCs(±s)

Fig 3Influence of curcumin on CBR1 and CBR2 protein expression(±s)

Fig 4 Effect of curcumin on protein expression of CBR1 by the fluorescence microscope

3 討論

我國是肝病大國，肝纖維化已經(jīng)成為影響人們身體健康的重大疾病。多年來學(xué)者們一直致力于尋找安全、有效的抗肝纖維化的藥物。已有研究證實(shí)姜黃素具有確切的預(yù)防和治療纖維化的作用，可明顯減輕多種損傷因子導(dǎo)致的肝臟損傷，并能明顯改善四氯化碳(CCl4)所致大鼠纖維化的病理學(xué)改變［7，11］。進(jìn)一步加強(qiáng)姜黃素對(duì)參與HSCs活化信號(hào)通路調(diào)控及ECM沉積干預(yù)機(jī)制的研究，對(duì)于闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新型、有效抗肝纖維化藥物至關(guān)重要。

以往對(duì)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，但近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素及其相應(yīng)的受體在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中也起一定作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CCl4或酒精誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型中，給予CBR2受體拮抗劑可以使肝纖維化的發(fā)生發(fā)展速度加快，纖維化程度明顯加重，而激活CBR2受體可以有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［12］。對(duì)CBR1受體研究發(fā)現(xiàn)，激活CBR1受體可以促進(jìn)肝纖維化發(fā)展，給予CBR1受體拮抗劑(例如:SR141716A)可以減輕肝臟急性損傷時(shí)肝組織損傷修復(fù)反應(yīng)，抑制肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程，給予CBR1基因敲除小鼠CCl4或酒精誘導(dǎo)肝纖維化，CBR1基因敲除小鼠肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展較正常組小鼠的速度明顯減慢，其纖維化程度也較正常組的減輕［6］。我們的研究發(fā)現(xiàn)體外激動(dòng)或者拮抗HSCs大麻素受體，則同樣能夠獲得與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相同的結(jié)果。這表明大麻素受體信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展過程的確實(shí)具有重要的作用。

Fig 5 Curcumin inhibited the expression of ECM components in HSCs stimulated by CBR1 agonist NADA(±s)

在肝纖維化發(fā)生時(shí)大麻素受體可能參與HSCs中的MAPK信號(hào)通路的調(diào)控［13－14］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn) CBR1的拮抗劑 AM251可抑制 HSCs中ERK、JNK的磷酸化水平。應(yīng)用姜黃素干預(yù)HSCs時(shí)，會(huì)導(dǎo)致CBR1表達(dá)降低。進(jìn)一步應(yīng)用大麻素受體激動(dòng)劑與拮抗劑分別進(jìn)行干預(yù)處理并觀察姜黃素對(duì)HSCs表達(dá)ECM成分的影響，姜黃素不僅能劑量依賴性的抑制CBR1激動(dòng)劑導(dǎo)致的ECM成分表達(dá)的上升，并可協(xié)同 CBR1拮抗劑抑制HSCs表達(dá)ECM成分的作用。結(jié)果表明姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞活化與增殖的作用部分依賴于對(duì)大麻素受體信號(hào)通路的干預(yù)作用。我們的研究證實(shí)了大麻素受體在姜黃素抑制HSCs增殖、活化中的重要作用。本研究為肝纖維化的研究及治療提供了新的思路，豐富了中藥在治療肝纖維化方面的機(jī)制研究，對(duì)推進(jìn)中藥治療肝纖維化的研究具有重要意義。但本研究同樣還有很多未解決的問題，比如:姜黃素是通過何種途徑影響大麻素受體表達(dá)的?大麻素受體又是怎樣影響ECM合成的等等，還需要進(jìn)一步的深入研究。

Fig 6 HSCs were treated with DMEM，or，curcumin and/or AM251 at the indicated concentrations for 24 h(±s)

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