周 珺，賈正平，2，邱建國，張泉龍，保 蕓，2，張汝學，2

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學重點學科，甘肅蘭州 730050;2.蘭州大學，甘肅蘭州 730000)

糖皮質激素(glucocorticoids，GC)作為降糖激素的反調激素，它對于維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著巨大的作用［1-2］，研究表明［2］，GC活性升高與胰島素抵抗密切相關，GC與其受體結合后，發(fā)揮著促進肝糖異生、葡萄糖轉運系統(tǒng)異常等多方面作用。本文采用高脂飼料加小劑量STZ聯(lián)合誘導的大鼠糖尿病模型模擬人類臨床2型糖尿病，研究HPA軸的功能變化及HPA軸調節(jié)劑，即糖皮質激素受體 (glucocorticoids receptor，GR)拮抗劑—米非司酮對HPA軸的調節(jié)作用，研究其對糖尿病大鼠血糖血脂代謝的影響。

1 材料、試劑及器材

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，♀，清潔級，體質量(200±20)g，由蘭州大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，生產許可證號:SCXK(甘)2009-0004，動物合格證號:No.0000789，自由攝食進水，室溫19℃ ～24℃。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司);米非司酮(mifepristone，MIF，北京紫竹藥業(yè));血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(四川邁克科技有限責任公司);胰島素放射免疫分析測定試劑盒(北京華英生物技術研究所);CRH、ACTH、CORT-ELISA測定試劑盒(R＆D公司)。生化分析儀(Vitalab ISP-21，Vital Scientific公司);電子天平(BP210S，賽多利斯有限公司);紫外可見分光光度計(HP-8453，美國惠普公司);離心機(IEC MICROMAX，Thermo Electron公司);酶標儀(Multiscan MK3，Thermo Electron公司)。

2 實驗方法

2.1 2 型糖尿病大鼠模型的建立、分組及給藥 大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，以高脂飼料飼養(yǎng)2個月，大鼠禁食16 h后給與STZ(30 mg·kg-1，i.p.)誘發(fā)2型糖尿病模型。將血糖值≥11.1 mmol·L-1大鼠納入實驗，分為糖尿病組、MIF-L組(10 mg·kg-1·d-1)、MIF-H 組(25 mg·kg-1·d-1)。連續(xù)灌胃(i.g.)給藥5周后，禁食6 h后斷頭處死并收集軀干血，4℃ 4 000 r·min-1離心10 min，血漿-20℃保存待用。

2.2 體重、血糖 每周測定一次空腹體重和血糖，測血糖前大鼠禁食不禁水6-7 h，乙醚麻醉后采血;實驗結束時斷頭處死大鼠，收集所有血液。0.1 mol·L-1肝素鈉抗凝，立即離心并分離血漿。用葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖含量。結果以mmol·L-1表示。

2.3 血脂的測定 血漿室溫解凍后測定血脂水平，TG用GPO-PAP法測定，TC用 COD-CE-PAP法測定，HDL-C用PTA-Mg2+沉淀法測定，LDL-C用聚乙烯硫酸沉淀法測定。結果以mmol·L-1表示。

2.4 血漿中激素水平的測定 血漿室溫放置解凍后，測定其中胰島素、CRH、ACTH及皮質酮水平。胰島素采用放免法測定，CRH、ACTH及皮質酮用ELISA測定，結果以mIU·L-1，ng·L-1，ng·L-1，μg·L-1表示。

2.5 肝糖原含量測定(蒽酮—硫酸法) 采用蒽酮-硫酸比色法測定肝糖原含量。結果以mg·g-1表示。

2.6 統(tǒng)計學處理 實驗數據用SPSS 11.5軟件處理，結果用±s表示，組間差異用t檢驗。

3 實驗結果

3.1 大鼠體重變化 與正常組相比，模型組大鼠體重明顯降低(P＜0.01)，MIF-L組體重明顯降低(P＜0.05)，MIF-H組大鼠體重無明顯下降;與模型組相比，第4周時，MIF-H組體重明顯升高(P＜0.01)。

Tab 1Effects of mifepristone on weight(g，±s)

Tab 1Effects of mifepristone on weight(g，±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

group n dose/mg·kg-1·d-10 week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week Control9 0 258.72±25.60 261.16±22.83 268.22±22.55 273.44±24.58 273.30±21.43 273.30±21.43 Model 8 0 234.61±28.59 219.65±31.76＊＊ 234.63±26.73* 231.88±30.86* 224.38±14.00＊＊ 220.13±17.8＊＊MIF-L 9 10 235.33±22.30 220.56±21.95＊＊236.66±25.23* 237.56±26.21* 238.96±23.21* 240.07±16.32*MIF-H 8 25 236.52±23.36 242.24±22.69 244.63±24.25 252.50±23.89 262.86±26.49##269.07±22.26##

3.2 米非司酮對血糖水平的影響 Tab 2結果顯示:相比較正常對照組，模型組和MIF-L、MIF-H各組大鼠血糖明顯升高，且均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，相比較模型組，給藥前各組血糖無明顯差異，造模后，模型組血糖逐漸升高，MIF給藥組空腹血糖低于模型組，MIF-H組在給藥第3周即可達到明顯降糖效果(P＜0.05)。

3.3 米非司酮對血脂水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠 TC(mmol·L-1)(3.88±1.35，P＜0.05)、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，MIF-L組TC含量明顯升高(3.79±1.46，P＜0.05);相比較糖尿病模型組，MIF可明顯降低LDL-C含量(1.79±0.31，P＜0.01)，有降低TC、TG含量，升高HDL-C含量趨勢。

Tab 2Effects of mifepristone on fasting glucose level(mmol·L-1，±s)

Tab 2Effects of mifepristone on fasting glucose level(mmol·L-1，±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

group n dose/mg·kg-1·d-1 FPG/mmol·L -1 0 week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week Control9 0 6.36±0.59 6.20±0.93 6.22±1.10 6.31±0.92 6.68±1.03 6.72±1.21 Model 8 0 20.19±6.40＊＊ 21.83±3.43＊＊ 24.44±3.44＊＊ 25.01±9.97＊＊ 25.92±6.21＊＊ 25.67±5.33＊＊MIF-L 9 10 20.11±6.61＊＊ 20.19±5.92＊＊ 23.02±5.12＊＊ 21.51±4.23＊＊ 21.21±6.96＊＊ 21.02±6.01＊＊MIF-H 8 25 19.89±7.15＊＊ 19.27±4.79＊＊ 18.79±8.13＊＊ 18.44±6.61＊＊# 18.22±6.06＊＊# 17.93±7.68＊＊#

3.4 米非司酮對激素水平的影響 與正常組相比，模型組血漿CORT及CRH水平和胰島素水平增高，MIF-H組使CORT、ACTH、CRH明顯高于正常(P＜0.05)，MIF-L和 MIFH均可使胰島素高于正常水平，但差異無顯著性(P＞0.05);與模型組相比，MIF-H可明顯升高ACTH水平(P＜0.01)。

Tab 3Effects of mifepristone on hormones(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

3.5 米非司酮對大鼠肝糖原的影響 相比較正常對照組(4.89±4.35)mg·g-1，模型組(4.42 ±3.48)mg·g-1和MIF-L組(4.55±3.78)mg·g-1大鼠肝糖原含量有所下降;相比較模型組，MIF-H(5.21±4.33)mg·g-1能增加肝糖原含量。

4 討論

本實驗結果證實，糖尿病大鼠體重降低，血糖升高，血脂紊亂，HPA軸激素水平增加，胰島素水平升高，肝糖原含量減少。這與相關研究報道一致［3］。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸分別在下丘腦、垂體和腎上腺水平產生三類激素:CRH、ACTH和GC(大鼠體內為皮質酮(CORT))，GC又反饋性的調節(jié)CRH和ACTH的合成分泌。本實驗糖尿病大鼠CRH和CORT水平升高，說明其負反饋調節(jié)已消失或減弱，HPA軸功能紊亂。

近年來，國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的發(fā)生與HPA軸功能紊亂有關，GC直接參與糖代謝調節(jié)［4］。長期慢性應激使HPA軸活性增高，GC生成釋放增加，其與受體結合后發(fā)揮相應的生物學效應，包括誘導胰島β細胞功能障礙［5］，拮抗胰島素的降糖作用，削弱胰島素對機體各方面的作用，促進脂肪分解、糖原異生，減少細胞對糖的攝取，使機體血糖升高，造成或加重組織胰島素抵抗，使糖代謝紊亂難以控制等［3，6-7］。

MIF是一種GR拮抗劑，它可抑制GC與其受體結合，使得GC無法發(fā)揮生物學效應。機體內游離的GC與GR結合后，可介導機體內從抗炎反應到血脂、蛋白、核酸代謝等一系列生物學效應。同時，GR作為參與調節(jié)糖代謝的激素受體，與進入體內循環(huán)的配體結合并啟動催化肝糖生成的相關酶的基因轉錄而發(fā)揮作用［8］。利用GR拮抗劑，一方面抑制過量的GC發(fā)揮作用，另一方面可抑制GR的過量表達，削弱其調控酶基因的作用，抑制糖異生的同時削弱胰島素抵抗，降低血糖水平。本實驗證實，低劑量的MIF對2型糖尿病大鼠糖脂代謝影響較弱，而MIF-H組可明顯緩解糖尿病大鼠體重的明顯下降，明顯降低糖尿病大鼠的高血糖，說明MIF可通過拮抗GC的作用從而達到改善2型糖尿病的目的。但是長期使用非選擇性GR拮抗劑，會使得糖皮質激素受體表達減少，導致HPA軸活性更加亢進，此方面有待進一步深入研究。

［1］Gagliardi L，Le Jeunne C.Corticosteroids and diabetes mellitus［J］.Presse Med，2012，41(4):393-9.

［2］Beaudry J L，Riddell M C.Effects of glucocorticoids and exercise on pancreatic β cell function and diabetes development［J］.Diabetes Metab Res Rev，2012，28(7):560-73.

［3］Taylor A I，F(xiàn)rizzell N，McKillop A M，et al.Effect of RU486 on hepatic and adipocyte gene expression improves diabetes control in obesity-type 2 diabetes［J］.Horm Metab Res，2009，41(12):899-904.

［4］努爾買買提·艾買提，阿迪力·阿布力米提，哈木拉提 吾甫爾.神經內分泌免疫網絡與復雜性疾病相關性研究進展［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2006，29(10):921-5.

［4］NURMMAT Amat，ADILJAN·Abilmit，HAMYRAT Uper.Research progression of the relationship between neuroendocring-immune network and complicate diseases［J］.J Xinjiang Med Univer，2006，29(10):921-5.

［5］Linssen M M，van Raalte D H，Toonen E J，et al.Prednisoloneinduced beta cell dysfunction is associated with impaired endoplasmic reticulum homeostasis in INS-1E cells［J］.Cell Signal，2011，23(11):1708-15.

［6］Bradley Zinker，Amanda Mika，Phong Nguyen，et al.Liver-selective glucocorticoid receptor antagonism decreases glucose production and increases glucose disposal，ameliorating insulin resistance［J］.Metabol Clin Exper，2007，(56):380-7.

［7］Prpic'-Kri?evac I，Canecki-Var?ic'S，Bilic'-C'urc'ic'I.Hyperactivity of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in patients with type 2 diabetes and relations with insulin resistance and chronic complications［J］.Wien Klin Wochenschr，2012，124(11-12):403-11.

［8］Yoon J C，Puigserver P，Chen G，et al.Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC-1［J］.Nature，2001，413(6852):125-6.