李湘瀲，劉叔文，楊 潔

(南方醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣 州 510515)

流感作為嚴重威脅公眾健康的病毒性傳染病防治形勢很不樂觀。每年約有15%～20%的人群被流感病毒感染，在美國導(dǎo)致約3.6萬人死亡，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致至少50萬人死亡［1］。流感病毒屬于RNA病毒的正粘病毒科，分為甲、乙、丙3個類型，其中甲型病毒最為常見也最容易發(fā)生變異。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為15個亞型(H1～H15)，N有9個亞型(N1～N9)。甲型流感病毒H5N1亞型是甲型流感病毒的一個高致病性亞型。近年，世界各地相繼出現(xiàn)H5N1亞型禽流感病毒感染人類的情況，感染死亡率高達60%，提示其具有造成大流行的潛能，因此高致病性禽流感和人禽流感的防治工作備受關(guān)注。目前，現(xiàn)有的治療藥物僅4種，且只作用于M2離子通道和神經(jīng)氨酸酶兩個靶點，遠不能滿足臨床和社會的需求。積極研究防治流感病毒的新型藥物，不僅是當前醫(yī)學界面臨的挑戰(zhàn)，也是關(guān)乎社會經(jīng)濟發(fā)展的重要課題。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶中含量最高的成分，占綠茶兒茶素類總量的0.10－0.15，它是2-連苯酚基苯駢吡喃與沒食子酸形成的酯，同時，因其結(jié)構(gòu)中有6個鄰位酚羥基而具有優(yōu)于其他兒茶素類化合物的許多性質(zhì)。目前國內(nèi)外大量研究證實其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗心血管疾病等作用，是一種極具開發(fā)潛力的天然產(chǎn)物，其中抗病毒的活性備受關(guān)注［2－4］。為此，文中對EGCG的抗甲型流感活性和作用機制進行了研究，為甲型流感病毒感染的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與質(zhì)粒 293T細胞和MDCK細胞，由本實驗室保存。細胞培養(yǎng)液為10%胎牛血清，10 000 U·L－1青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。

A/Thailand/Kan353/2004-HA和 A/Thailand/Kan353/2004-NA質(zhì)粒由Frank Kirchhoff教授(University of Ulm，Germany)惠贈。pNL4-3R-E-Luc來自美NIH的AIDS Research and Reference Reagent Program。pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3進行移碼突變使其不表達Env蛋白和Vpr蛋白，并插入綠色熒光蛋白基因的一個重組質(zhì)粒。

1.1.2 病毒株 甲型流感病毒FM_1株(A/FM/1/47，H1N1)由南方醫(yī)科大學熱衛(wèi)系趙衛(wèi)教授惠贈，經(jīng)本實驗室SPF雞胚傳代擴增，－80℃保存。

1.1.3 試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基，新生胎牛血清，胰蛋白酶，青霉素及鏈霉素購自中國Invitrogen公司;熒光素酶檢測試劑盒以及細胞裂解液購自Pro-mega公司;感受態(tài)細胞DH5α由香港Dgen公司制備;轉(zhuǎn)染試劑PEI購自起福生物科技有限公司;神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒購自碧云天公司;其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 化合物與樣品 EGCG(純度 ＞98%)購于廈門勛健中藥植物化學有限公司;陽性對照藥物CL-385319由本實驗室合成，含量99.7%;利巴韋林鹽酸鹽由廣州肇慶星湖生物化學制藥廠生產(chǎn)，含量99.5%。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測EGCG對 H5N1假病毒進入的抑制作用 以每孔1×104個MDCK細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h;50 μl不同濃度的化合物與50 μl假病毒在37℃下孵育30 min，陽性對照藥為CL-385319［5］。將孵育后的病毒與化合物的混合物共同加入到MDCK細胞中，48 h后，根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒說明書，檢測化學發(fā)光值，判斷藥物抑制病毒進入的活性。

化合物抑制率/%=［1－(E－N)/(P－N)］×100%。

E代表實驗組的化學發(fā)光值，N代表陰性對照組的化學發(fā)光值，P代表陽性對照組的化學發(fā)光值?；衔锏陌霐?shù)抑制濃度(IC50)作為化合物的抗流感病毒活性的指標。

1.2.2 神經(jīng)氨酸酶抑制實驗 按照碧云天神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒說明書操作。在96孔熒光酶標板內(nèi)每孔加入70 μl神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液，然后每孔加入10 μl神經(jīng)氨酸酶，再每孔加入10 μl各個濃度的化合物，振動搖勻1 min后與37℃孵育2 min;加入10 μl的神經(jīng)氨酸酶熒光底物，再振動1 min，37℃孵育20 min進行熒光測定。

1.2.3 兩種給藥方式檢測EGCG對甲流FM_1株病毒的抑制活性 取處于指數(shù)生長期的MDCK細胞鋪在96孔板上，細胞數(shù)為1×104個/孔，長成單層分別以2種不同方式進行抗流感病毒試驗［6］:①EGCG對流感病毒侵入MDCK細胞的阻斷作用(預(yù)防作用):在EGCG無毒濃度范圍內(nèi)，以不同濃度的藥物預(yù)先與細胞孵育2 h，用PBS洗滌，每孔加入含有100 TCID50的病毒液感染細胞，當病毒對照孔細胞病變達到75%以上時，記錄細胞病變結(jié)果，判斷藥物療效。②藥物對流感病毒的治療作用:先以100 TCID50的病毒液感染細胞，37℃培養(yǎng)2 h后，用PBS洗滌，加入不同濃度的藥物，同上法培養(yǎng)與檢查。實驗同時設(shè)正常細胞對照組、病毒對照組、陽性藥物病組，與實驗組同時觀察CPE。采用MTT法［7］測定EGCG對細胞的毒性。確定半數(shù)毒性濃度(TC50)。Reed-muench 法［8］計算流感病毒 FM1在MDCK細胞中的組織半數(shù)感染量(TCID50)、半數(shù)抑制濃度(IC50)。計算治療指數(shù)(TI)，TI=TC50/IC50。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對H5N1禽流感病毒的進入有抑制作用 我們利用高致病性禽流感H5N1假病毒體系評價EGCG對H5N1A/Thailand/Kan353/2004毒株的抑制活性。由于pNL4-3R-E-Luc帶有熒光素酶報告基因，當假病毒成功感染MDCK細胞后，熒光素酶在細胞內(nèi)表達。表征熒光素酶活性的化學發(fā)光值與假病毒的感染能力成正比。如Fig 1A所示，病毒原液2倍稀釋時化學發(fā)光值達到了107，表明制備的H5N1假病毒具有很強的感染能力。通過檢查細胞裂解液的化學發(fā)光值，可以判定化合物的抑制活性。研究表明，EGCG能抑制H5N1假病毒的活性，其IC50為 145.10 μmol·L－1。EGCG 對 VSVG 假病毒沒有抑制作用。由于這兩種假病毒的制備只是轉(zhuǎn)入的包膜蛋白質(zhì)粒不同，因此EGCG抗H5N1假病毒的靶點為血凝素蛋白蛋白或神經(jīng)氨酸酶，見Fig 1B。

2.2 EGCG對神經(jīng)氨酸酶的抑制活性 我們用試劑盒檢測了EGCG對神經(jīng)氨酸酶的活性的影響。EGCG對神經(jīng)氨酸酶具有明顯的抑制活性，IC50為417.20 μmol·L－1，見 Fig 2。

2.3 EGCG能明顯抑制甲流FM_1活病毒 MTT法測 EGCG 的 TC50為 399.21 μmol·L－1，采用預(yù)防給藥方式，EGCG對H1N1型甲流病毒FM_1株的IC50為 6.88 μmol·L－1，TI為 58.02。采用治療給藥方式，EGCG對H1N1型甲流病毒FM_1株的IC50為14.83 μmol·L－1，TI為 26.92。CPE 觀察結(jié)果顯示，無論治療給藥還是預(yù)防給藥方式，EGCG均能不同程度地抑制流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)增殖。相同的給藥方式下，隨著藥物作用濃度的升高，抑制作用增強。

3 討論

EGCG是綠茶中提取的一種活性成份，由于具有多種生物活性而備受關(guān)注，尤其對EGCG抗流感病毒的作用的研究日益加深［9－10］。我們的前期研究已證明EGCG和EGCG衍生物能夠通過抑制gp41六螺旋束核心結(jié)構(gòu)的形成而阻止HIV病毒的進入［11］。高致病性禽流感(H5N1)是一種人禽共患的正粘病毒科流感病毒屬病毒引起的急性接觸性傳染病，病毒毒性很強，死亡率高。

本研究采用H5N1假病毒體系檢測EGCG對病毒的抑制作用。H5N1假病毒檢測體系適用于高通量篩選流感病毒的進入抑制劑，具有高效、穩(wěn)定、安全的特點［7］。假病毒尚失了病毒的自我復(fù)制能力，只具有單輪感染性，生物安全性高，可以在生物安全2級實驗室完成。

Fig 1 A:Infectivity of H5N1 pseudoviruses in MDCK cells.B:Inhibitory activity of EGCG against H5N1pseudoviruses.C:Inhibitory activity of CL-385319 against H5N1 pseudoviruses

研究表明，EGCG對源自A/Thailand/Kan353/2004的H5N1假病毒毒株有明顯的抑制作用，但對VSVG假病毒沒有抑制活性。由于兩種假病毒僅是包膜蛋白不同，表明EGCG是特異性作用于H5N1流感病毒的包膜蛋白，即血凝素(hemagglutinin，HA)或神經(jīng)氨酸酶。

Fig 2 Inhibitory activity of EGCG against H5N1 neuraminidase

流感病毒進入靶細胞是由病毒包膜上的血凝素介導(dǎo)的。該蛋白由HA1和HA2兩個亞基組成，其中HA1亞基與靶細胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，HA2則為跨膜亞基，介導(dǎo)病毒膜與胞內(nèi)體膜的融合［12］。EGCG的血凝抑制實驗為陰性(結(jié)果未提供)，表明EGCG的作用位點不是HA1亞基上的唾液酸受體結(jié)合區(qū)域，因此其抑制流感病毒進入的作用位點可能是HA2亞基。神經(jīng)氨酸酶是流感病毒表面的重要蛋白。EGCG也能抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，表明EGCG對神經(jīng)氨酸酶的抑制可能也是其抗流感病毒機制之一。

根據(jù)HA的同源性分型，H1和H5亞型流感屬于同一組別。為此，我們檢測EGCG體外抑制H1亞型流感病毒FM_1株的作用。EGCG對于2種不同的給藥方式(治療給藥和預(yù)防給藥)，體外對H1N1型甲流病毒FM_1株均具有抑制作用，但抑制作用存在著一定差異，預(yù)防模式優(yōu)于治療模式，其原因可能是預(yù)防模式時，吸附在細胞表面的EGCG能發(fā)揮病毒進入抑制的作用，而治療模式在接種后給藥，病毒已經(jīng)進入靶細胞，導(dǎo)致EGCG的進入抑制作用不能發(fā)揮。

本研究結(jié)果提示了EGCG在體外具有明顯的抗甲型流感病毒作用，可作用于H5N1禽流感病毒的進入階段，同時能夠在一定程度上抑制病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，說明EGCG是通過多靶點作用而發(fā)揮抗H5N1禽流感病毒的作用。EGCG體外抗甲型流感病毒作用的研究為EGCG的開發(fā)、利用以及進一步研究提供了重要依據(jù)。

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