曾建紅，黃健瑩，曾軍，胡廣奮

（廣州市第一人民醫(yī)院，廣州 510180）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見病、多發(fā)病，病死率高，社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重。氣道炎癥和氣道重塑是COPD主要的病理生理學(xué)特征，研究其病理改變及發(fā)生機制對增強其防治效果及改善患者預(yù)后具有重要意義［1］。Rho／Rho 激 酶 （Rho－associated coiled－coil forming kinase，ROCK）信號通路是機體各組織細(xì)胞普遍存在的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Rho／Rho激酶信號通路參與了COPD的發(fā)病過程，Rho激酶抑制劑可抑制炎癥細(xì)胞的遷移和趨化、拮抗炎性因子分泌、阻斷炎性因子作用，從而發(fā)揮抗炎作用，改善氣道重塑［2］。本課題主要研究ROCK信號通路在COPD大鼠模型氣道中的表達(dá)及其對氣道重塑的作用。通過建立COPD大鼠動物模型，分析ROCK信號通路在COPD大鼠氣道中的表達(dá)及其對支氣管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam）的影響，探討ROCK信號通路在COPD大鼠氣道重塑中的作用，為臨床防治COPD提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動物模型的分組與建立

清潔級相同重量級Wistar大鼠60只，隨機分為正常對照組、COPD組、Y－27632干預(yù)組，每組20只。3組大鼠在相同的環(huán)境下采用相同的喂養(yǎng)方式。對照組為正常大鼠，飼養(yǎng)至90d；COPD組采用香煙霧熏加脂多糖（LPS）氣管滴入方法復(fù)制大鼠COPD模型：分別于試驗的第1、8、15、23天將LPS 200μg／200μL注入大鼠氣管內(nèi)，于第2～7天和第9～14天將上述處理后的大鼠放入熏箱內(nèi)，1次／d，每次被動吸煙（雙喜牌）4支，持續(xù)30min；連續(xù)2w后，停止香煙染毒，繼續(xù)飼養(yǎng)至90d。Y－27632干預(yù)組在建立COPD大鼠模型過程中，試驗的第1、8、15、23天將LPS 200μg／200μL注入大鼠氣管內(nèi)1 h后，每次腹腔注射Y－27632溶液0.1mL，同樣飼養(yǎng)至90d。

1.2 肺組織標(biāo)本留取、制作及觀察

第91天處死大鼠后，即刻打開胸腔，暴露肺組織，觀察肺組織大體改變后，剪切左肺肺門中下肺段，用4%多聚甲醛固定4～6h，脫水、包埋、切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察支氣管及血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤情況。左肺門上段肺組織迅速置于液氮，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Wat和 Wam測量

每只大鼠挑選3～5支有完整橫斷面的中小支氣管，采用Image－proplus圖像分析軟件測量肺內(nèi)支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管總面積（Wat1）、管腔面積（Wat2）、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積（Wam1）、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積（Wam2），并用Pbm 標(biāo)準(zhǔn)化，即 分 別 以 （Wat1－Wat2）／Pbm 和 （Wam1－Wam2）／Pbm來表示 Wat和 Wam。

1.4 肺組織中ROCKⅡ蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組織化學(xué)SABC法（鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法），嚴(yán)格按上海生工生物工程技術(shù)有限公司訂購的試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.5 肺組織RhoA，ROCKⅡmRNA表達(dá)檢測

采用RT－PCR法，采用異硫氰酸胍－苯酚－氯仿法提取大鼠肺組織RNA，反應(yīng)體系按試劑盒說明書加入引物、RNA樣品、Taq酶，加無菌雙蒸水使反應(yīng)體系達(dá)到50μL，逆轉(zhuǎn)錄條件為38℃30min，取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃ 延伸30s，35個循環(huán)，72℃再延伸5min，取5μL產(chǎn)物在濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)分析處理，計算灰度值［3］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間的差異性比較運用單因素方差分析，采用LSD進(jìn)行組間的兩兩比較，檢驗標(biāo)準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的Wat和Wam對比

與對照組相比，COPD組和Y－27632干預(yù)組大鼠支氣管的Wat和Wam都明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Y－27632 干預(yù)組大鼠與COPD組大鼠相比，Wat和Wam都有明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 各組大鼠的Wat和Wam對比

2.2 RhoA，ROCKⅡmRNA在各組大鼠肺組織中的表達(dá)比較

ROCKⅡ蛋白在COPD組和Y－27632干預(yù)組大鼠中的表達(dá)與對照組相比均有所增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與COPD組相比，ROCKⅡ蛋白在Y－27632干預(yù)組大鼠的肺組織中表達(dá)量有所降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RhoA mRNA和ROCKⅡmRNA表達(dá)具有一致性，與對照組相比，RhoA，ROCKⅡmRNA在COPD組和Y－27632干預(yù)組中的表達(dá)均有所增高，且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與 COPD組相比，RhoA，ROCKⅡmRNA的表達(dá)在Y－27632干預(yù)組中又有明顯的降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 RhoA，ROCKⅡmRNA在各組大鼠肺組織中的表達(dá)比較

3 討論

COPD的主要特征為氣道炎癥和氣道重塑，在COPD患者中，支氣管肺組織的炎癥、損傷、修復(fù)和重塑是一個不斷進(jìn)展的病理過程。氣道炎癥是COPD的起始階段，氣道重塑是COPD氣流阻塞的病理基礎(chǔ)，是COPD病變持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，研究其病理改變及發(fā)生機制對增強其防治效果及改善患者預(yù)后具有重要意義。氣道平滑肌細(xì)胞不僅是氣道重塑重要的效應(yīng)細(xì)胞，而且還主動參與氣道的炎癥反應(yīng)。Rho／Rho激酶信號通路是機體各組織細(xì)胞普遍存在的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài)，參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞黏附與遷移、細(xì)胞增殖與凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、平滑肌收縮等多種生物學(xué)行為，介導(dǎo)了多種平滑肌與非平滑肌功能異常相關(guān)疾病的發(fā)生機制，是近年來研究的熱點之一。Rho激酶通過激活ROCK作用于氣道的平滑肌細(xì)胞，或調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎性因子等的產(chǎn)生，影響氣道重塑的發(fā)生和進(jìn)展。COPD患者氣道均有不同程度的增厚，從而導(dǎo)致氣道的狹窄，主要原因有氣道平滑肌的增生、肥大，或是基底膜增厚，從而導(dǎo)致氣道的阻塞和高反應(yīng)性。有研究［4］顯示，在多種疾病氣道高反應(yīng)性動物模型研究中均發(fā)現(xiàn)其支氣管的平滑肌細(xì)胞中Rho激酶的表達(dá)明顯增加，由此更加說明Rho／Rho激酶信號通路與氣道的重塑存在著密切的關(guān)系。平滑肌細(xì)胞的活化和增殖是氣道高反應(yīng)和氣道重塑的主要原因。有研究表明ROCKⅡ特異性拮抗劑Y－27632能減少哮喘小鼠氣道壁和氣道平滑肌的增殖程度，抑制與平滑肌增殖相關(guān)的信號通路的關(guān)鍵分子RhoA、ROCKⅡ的表達(dá)，從而抑制氣道重塑。Rho／Rho激酶信號通路參與了COPD的發(fā)病過程，Rho激酶抑制劑可抑制炎癥細(xì)胞的遷移和趨化、拮抗炎性因子分泌、阻斷炎性因子作用，從而發(fā)揮抗炎作用，改善氣道重塑。

本研究結(jié)果顯示COPD組大鼠RhoA，ROCKⅡmRNA 表達(dá)明顯增高，而 Y－27632干預(yù)組RhoA，ROCKⅡmRNA表達(dá)相對于COPD組有所降低（P＜0.05），因此說明應(yīng)用ROCKⅡ特異性拮抗劑Y－27632能夠下調(diào)RhoA，ROCKⅡmRNA表達(dá)；同時ROCKⅡ特異性拮抗劑Y－27632能有效干預(yù)大鼠的氣管壁增厚和平滑肌增殖，結(jié)果顯示Y－27632干預(yù)組大鼠的Wat、Wam明顯低于COPD組大鼠（P＜0.05）。RhoA，ROCKⅡmRNA的表達(dá)與大鼠支氣管 Wat、Wam的改變具有一致性，說明Rho激酶抑制劑Y－27632能夠抑制RhoA，ROCKⅡmRNA的表達(dá)和平滑肌細(xì)胞的增生，從而有效地改善氣道重塑。

綜上所述，Rho／ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與氣道的重塑存在密切的關(guān)系，通過進(jìn)一步研究Rho／ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在氣道重塑中的作用和機制，有助于我們對COPD發(fā)病機制的認(rèn)識，為COPD的基礎(chǔ)研究和臨床防治工作提供新的理論依據(jù)和防治措施。

［1］Taki F，Kume H，Kobayashi T，et al.Effects of Rho－kinase inactivation on eosinophilia and hyper－reactivity in murine airways by allergen challenges［J］.Clinical ＆ Experimental Allergy，2007，37（4）：599－607.

［2］Vardouli L，Vasilaki E，Papadimitriou E，et al.A novel mechanism of TGFβ－induced actin reorganization mediated by Smad proteins and Rho GTPases［J］.FEBS Journal，2008，275（16）：4074－4087.

［3］項薔薇，朱妍艷，羅運春，等.Rho／Rho激酶在哮喘小鼠氣道的表達(dá)及其對氣道重塑的影響［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2011，33（8）：1127－1129.

［4］Jiao X，Katiyar S，Liu M，et al.Disruption of c－Jun reduces cellular migration and invasion through inhibition of c－Src and hyperactivation of ROCK II kinase［J］.Mol Biol Cell，2008，19（4）：1378－1390.