孫 凱,李 佳,2,張永清,2＊

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南250355;2.山東省高校中藥資源學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南250355)

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。味辛、甘,大熱,有毒;歸心、腎、脾經(jīng);具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛等功效;用于亡陽(yáng)虛脫,肢冷脈微,心陽(yáng)不足,胸痹心痛,虛寒吐瀉,脘腹冷痛,腎陽(yáng)虛衰,陽(yáng)痿宮冷,陰寒水腫,陽(yáng)虛外感,寒濕痹痛等癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),附子含有多糖、脂類、醇胺、生物堿等成分,具有強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)靜、降糖等活性,并能興奮垂體—腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)[1],用于治療心力衰竭、胸痹等疾病[2-3]。在生物堿類成分中以雙萜類生物堿最為重要,如烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等,它們既是活性成分又是毒性成分[4],為保證附子飲片質(zhì)量需要將其含量控制在一定范圍內(nèi)。產(chǎn)地加工與炮制是影響附子中生物堿含量的重要環(huán)節(jié),從而對(duì)其飲片質(zhì)量有著非常重要的影響[5]。附子傳統(tǒng)加工工藝加工的商品附子多達(dá)11個(gè)規(guī)格,除《中國(guó)藥典》品種黑順片、白附片、淡附片、炮附片以外,還有熟附片、掛片、黃附片、刨附片等[6]。其中有的去皮,有的不去皮。不同加工炮制品中,生物堿類成分含量具有明顯差異。探討附子中生物堿類成分的組織分布狀況,對(duì)于確定適宜的加工炮制方法、有效控制附子飲片質(zhì)量具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京永光明醫(yī)療儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(北京醫(yī)療設(shè)備廠);101C-Z型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠);四元泵,在線脫氣機(jī),手動(dòng)進(jìn)樣器,Agilient Chem Station色譜工作站,TC-C18柱(5 μ m,4.6 mm×250 mm),紫外吸收檢測(cè)器;微孔濾膜;FA 1004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);AGB5型電子天平(美國(guó)METTLER TOLEDO公司);電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永鑫儀器廠);KQ-250E醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

1.2 試劑 娃哈哈純凈水;甲醇(一級(jí)色譜純,天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)、乙腈(一級(jí)色譜純,Tedia Company,INC.1000 Tedia Way,Fairfield,OH 45014 USA);標(biāo)準(zhǔn)品:烏頭堿(302-27-2)、新烏頭堿(2752-64-9)、次烏頭堿(6900-87-4)均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn),純度≥98%。其余試劑,均為國(guó)產(chǎn)、分析純。

1.3 藥材 上海康橋中藥飲片有限公司提供,2012年7月采集自四川省江油市,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定,確認(rèn)為毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaeli Debx.的子根,鮮品。取子根適量,用刀片從外向內(nèi)依次將表皮與皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓等組織分開,分別編號(hào)為H1、H2、H3、H4;從頂端到底端平均分成9 部分,分別編號(hào)為 Z1 、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9。將分離后的各個(gè)部分,曬干,以粉碎機(jī)粉碎,過60目篩,置干燥器中備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液制備 取干燥粉碎后的藥粉約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加10%氨水3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)的混合溶液50 mL,稱定重量,超聲提取30 min,放冷,再稱定重量,用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL,40℃以下減壓回收溶劑至干,殘?jiān)芗尤氘惐?三氯甲烷(1∶1)的混合溶液3 mL溶解,濾過,濾液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容并搖勻,過0.45 μ m濾膜,作為供試品溶液備用。

2.2 色譜條件 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱C18(ODS,250 mm ×4.60 mm,5 μ m);檢測(cè)波長(zhǎng) :240 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μ L 。流動(dòng)相梯度洗脫條件,見表1。

表1 進(jìn)樣梯度洗脫程序

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系 精密稱取烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,置10 mL容量瓶中,加0.05%鹽酸-甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品貯備液A、B、C,濃度為1.0 mg/mL,分別稀釋配成 0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL的溶液,作為對(duì)照品線性溶液,精密吸取對(duì)照品溶液各 20 μ L,按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定 ,以峰面積與濃度進(jìn)行回歸,得到烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿在0.1～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取S6溶液各20 μ L,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,RSD=1.92%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下操作,制備6份S6供試品溶液 ,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣 20 μ L,測(cè)定峰面積,RSD=2.74%(n=6),表明重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取S6溶液各20 μ L,分別于0,2,4,6,8,12 h各進(jìn)樣1次,測(cè)定峰面積,RSD=1.33%(n=6),表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的S6號(hào)樣品6份,各0.5 g,分別精密加入烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對(duì)照品適量,按“2.1”項(xiàng)下制備樣品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。分別進(jìn)樣3次,根據(jù)公式(C-A)/B×100%計(jì)算,結(jié)果平均加樣回收率為94.53%,RSD=1.84%,表明具有較好回收率。

2.4 樣品含量測(cè)定 取各樣品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的峰面積,根據(jù)各生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。每樣品重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 生物堿在附子中的橫向分布 將附子由外向內(nèi)大體將表皮與皮層、韌皮部、木質(zhì)部及髓部分開,經(jīng)測(cè)定,其烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿含量如表3所示。

表3 附子中生物堿的橫向分布情況

表3結(jié)果顯示,新烏頭堿、烏頭堿與次烏頭堿在附子各組織中的分布狀況是不一樣的,新烏頭堿、次烏頭堿及總生物堿均以韌皮部含量最高、表皮與皮層含量最低,而烏頭堿卻以髓部含量最高、韌皮部含量最低。

3.2 生物堿在附子中縱向分布 用刀片將附子從頂端至底端分割為9個(gè)部分,分別測(cè)定其生物堿含量,結(jié)果如表4所示。

表4 附子中生物堿的縱向分布情況

表4結(jié)果顯示,附子從頂端至底端新烏頭堿、烏頭堿含量最高的部位分別為第2節(jié)段、第9節(jié)段,次烏頭堿、總生物堿含量最高的部位為第1節(jié)段,新烏頭堿含量最低的部位為第5節(jié)段,烏頭堿、次烏頭堿及總生物堿含量最低的部位均為第4節(jié)段。各種生物堿含量變化的大體趨勢(shì)均表現(xiàn)為先降低后升高再降低。

4 小結(jié)

生物堿屬于植物次生代謝物質(zhì),其合成與積累與植物體內(nèi)的生理生化代謝活動(dòng)密切相關(guān)。一般來講,代謝越旺盛的部位,次生代謝物質(zhì)合成與積累的越多,含量越高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿及總生物堿在附子中的分布具有一定的規(guī)律性。在橫向上,以韌皮部含量最高,表皮與皮層含量最低;在縱向上,上端含量最高,往下不斷降低,然后又有升高和降低,直徑最大部位的生物堿含量較低。附子生物堿分布的規(guī)律性,決定于根部生理生化代謝活動(dòng)。韌皮部具有輸導(dǎo)有機(jī)物質(zhì)的作用,其代謝活動(dòng)強(qiáng)烈,所以其中的生物堿含量較高。表皮、皮層、木質(zhì)部、髓部死亡細(xì)胞較多或發(fā)揮貯藏功能,代謝強(qiáng)度相對(duì)較低,所以其生物堿含量較低。根部上端是母根相連處,各種維管束比較集中,代謝活動(dòng)強(qiáng),生物堿含量高。在中部直徑較大的部位,貯藏組織發(fā)達(dá),其皮層與髓部所占比例相對(duì)較大,所以生物堿含量偏低。根部下端貯藏組織減少,微管組織相對(duì)發(fā)達(dá),所以其含量又有升高。根部末端表皮與皮層所占比例增大,使得生物堿含量再次降低。掌握附子生物堿分布規(guī)律,可為選擇加工炮制方法、控制飲片質(zhì)量提供參考,如去除子根頂端和低端、去皮時(shí)深達(dá)木質(zhì)部等均可以有效降低生物堿含量。

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