高姍姍，段維軍，陳先鋒，張慧麗，陳 炯，朱水芳

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院寧波315211;2.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，寧波315012;3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院植物檢疫研究所，北京100121)

石莼屬(Ulva sp.，以往稱(chēng)為石莼屬和滸苔屬)隸屬于綠藻門(mén) (Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)［1，2］。廣泛分布在世界各大洋中，常生長(zhǎng)在高低潮間帶的巖石上或石沼中，有時(shí)也可附生在大型海藻的藻體和船舶的外殼之上。綠潮(Green tides)是綠藻門(mén)大型海藻暴發(fā)性增殖或高度聚集，從而導(dǎo)致多方面次生危害的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象，絕大部分該類(lèi)綠潮是由石莼屬綠藻所造成的，現(xiàn)已成為一種世界性的海洋環(huán)境問(wèn)題。

近年來(lái)，中國(guó)山東近海連續(xù)發(fā)生大規(guī)模綠潮災(zāi)害，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)、環(huán)境、資源與沿海經(jīng)濟(jì)造成了不同程度的影響。2008年夏季，中國(guó)山東青島地區(qū)經(jīng)歷了世界上迄今為止規(guī)模最大的一次綠潮災(zāi)害。綠潮覆蓋面積13000平方公里，綠潮清理工作動(dòng)用了過(guò)萬(wàn)人員和1400余艘船只，清理出超過(guò)100余萬(wàn)噸的綠潮藻［3，4］。2009年7月，青島再次爆發(fā)大規(guī)模綠潮災(zāi)害，覆蓋面積達(dá)19000平方公里，持續(xù)時(shí)間超過(guò)一個(gè)月［5］。2010年7月初綠潮最大覆蓋面積和分布面積分別達(dá)到了530平方公里和29800平方公里［6］。2011年7月，綠潮最大覆蓋面積和分布面積分別達(dá)到了560平方公里和26400平方公里［7］。山東近海綠潮災(zāi)害爆發(fā)面積大，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，大量涌入近岸海域，對(duì)漁業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、海洋環(huán)境、景觀和生態(tài)服務(wù)功能產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。

綠潮藻的種類(lèi)鑒定是解決該類(lèi)問(wèn)題的首要步驟。然而，石莼屬綠藻，特別是漂浮石莼屬綠藻，由于其高度形態(tài)可塑性以及缺少可用于形態(tài)鑒定的特征，非常難于鑒定。近年來(lái)，根據(jù) internal transcribed spacer(ITS)片段或者large subunit of the ribulose-bisphosphate carboxylase(rbcL)等片段序列分析結(jié)果，對(duì)石莼屬內(nèi)種類(lèi)劃分方面已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)展［1］。在以往對(duì)2008年—2009年綠潮藻種類(lèi)鑒定研究中，根據(jù)漂浮綠潮藻高度分枝和中空的形態(tài)特征，綠潮藻被鑒定為U.prolifera［8］，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析研究，有研究報(bào)告指出該綠潮藻屬于 U.linza-procera-prolifera(LPP)分枝［9］，也有結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察或雜交試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道其為U.prolifera［10］，但是Kim等的研究卻指出該綠潮藻為U.linza［11］。山東近海綠潮災(zāi)害連年爆發(fā)，其2010年和2011年種類(lèi)組成是否發(fā)生變化，對(duì)此尚未有研究予以解決。準(zhǔn)確地綠潮種類(lèi)組成鑒定對(duì)于其防控工作開(kāi)展以及追溯其來(lái)源具有重要意義，為此我們開(kāi)展了本項(xiàng)研究。

表1 采集石莼屬樣品信息Table 1 The information of collected Ulva samples

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理

于2010年—2011年在山東近海綠潮發(fā)生地采集石莼屬樣品，樣品信息見(jiàn)表1。采用無(wú)菌水仔細(xì)清洗新鮮藻體，洗去泥砂和其它附著物，用吸水紙吸干表面水分，儲(chǔ)存于4℃條件下，用于形態(tài)學(xué)觀察和DNA提取。

1.1.2 試劑

Taq 酶、MgCl2、10 × PCR buffer、DL2000 Marker、DNA片段純化試劑盒和凝膠純化試劑盒、pMD19-T載體均購(gòu)自寶生物(Takara);Plant Genomic DNA Kit試劑盒購(gòu)自天根公司;實(shí)驗(yàn)用引物由上海英俊合成;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察

形態(tài)學(xué)觀察的標(biāo)準(zhǔn)參照Duan等［12］方法進(jìn)行。

1.2.2 基因組DNA的提取

利用天根Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN.，China)試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.2.3 ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列的擴(kuò)增及克隆

用于ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列擴(kuò)增的引物、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照Duan等［12］方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，進(jìn)行ITS、rbcL和5S rDNA間隔序列的基因克隆，挑選陽(yáng)性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

圖1 滸苔樣品2011S62A的形態(tài)特征Fig 1 Microscopic details of Ulva prolifera，2011S62A

表2 根據(jù)形態(tài)特征31株黃海采集石莼屬樣品分屬于3種不同形態(tài)類(lèi)群Table 2 Based on morphology，the 31 samples of Ulva spp.from the Shangdong Coast can be divided into three groups

圖2 孔石莼樣品2011S65B的形態(tài)特征Fig 2 Microscopic details of Ulva pertusa，2011S65B

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載用于石莼屬I(mǎi)TS、rbcL和5S rDNA間隔序列分析的序列。將測(cè)得的序列與Genbank中下載的序列用CLUSTAL X程序進(jìn)行同源性分析，使用MEGA5.0軟件［13］中的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)1000次計(jì)算Bootstrap值。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征

樣品2010S44等，共計(jì)18個(gè)，占供試樣品的58%，其形態(tài)特征與 Tseng 等［14］、Heesch 等［15］描述的滸苔(U.prolifera)的形態(tài)特征基本一致(表2，圖1)。樣品2010S43等，共計(jì)12個(gè)，占供試樣品的38.7%，其形態(tài)特征與 Tseng 等［14］、Heesch 等［16］、Aguilar-Rosas 等［17］描述的孔石莼(U.pertusa)的形態(tài)特征基本一致(表2，圖2)。樣品2010S49，共計(jì)1個(gè)，占供試樣品的3.2%，形態(tài)特征與 Tseng 等［14］，Blomster等［18］描述的扁滸苔(U.compressa)的形態(tài)特征基本一致(表2，圖3)。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 ITS和rbcL系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

ITS片段由870 bp左右堿基構(gòu)成，而rbcL片段長(zhǎng)度約為1270 bp。31株山東近海收集的石莼屬樣品被劃分到3個(gè)不同的分枝。最大的一個(gè)分枝包括18個(gè)樣品，包含2010年綠潮藻樣品5株和2011年綠潮藻樣品13株，它所獲得的 bootstrap值分別為100/100(ITS/rbcL);12株樣品屬于 U.pertusa分枝，bootstrap值分別為100/100(ITS/rbcL);樣品2010S49屬于U.compress分枝，bootstrap值分別為100/100(ITS/rbcL)(圖4、圖5)。

圖5 根據(jù)石莼屬rbcL序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig 5 Phylogenetic tree of the neighbor-joining(NJ)analysis inferred from the nuclear encoded rbcL regions of Ulva

2.2.2 5S rDNA間隔序列的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

5S rDNA間隔序列片段由445 bp左右堿基構(gòu)成，根據(jù)5S rDNA間隔序列片段的分析構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。18株屬于LPP分枝的樣品均被劃分到了U.prolifera分枝，其bootstrap支持值為100，在所采集的漂浮樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)緣管滸苔U.linza(圖6)。

圖6 根據(jù)石莼屬5S rDNA間隔區(qū)序列采用鄰接法構(gòu)建的無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig 6 Unrooted neighbor-joining(NJ)tree of the 5S rDNA spacer region of the LPP clade

3 結(jié)論與討論

對(duì)于石莼屬物種鑒定，僅使用形態(tài)學(xué)方法面臨一些問(wèn)題。石莼屬形態(tài)特征復(fù)雜，少數(shù)形態(tài)特征會(huì)隨環(huán)境的變化而變化，如U.intestinalis通常沒(méi)有分枝，而U.compressa有分枝，但是低鹽或鹽休克可以誘導(dǎo)U.intestinalis形成分枝［18］。同時(shí)，傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)家數(shù)量在逐漸減少，針對(duì)某一特定類(lèi)群專(zhuān)家相對(duì)更少。目前對(duì)于石莼屬種類(lèi)的鑒定已經(jīng)越來(lái)越多的借助于分子生物學(xué)的方法，通過(guò)使用DNA序列分析的方法推斷類(lèi)群間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，完成物種鑒定，這一技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類(lèi)方法的不足。

盡管ITS和rbcL序列能夠?qū)⑹粚賰?nèi)大多數(shù)種類(lèi)區(qū)分開(kāi)，表現(xiàn)出其在石莼屬種類(lèi)劃分中的重要作用，但對(duì)于LPP(U.linza-procera-prolifera)分枝中的U.linza、U.procera(現(xiàn)已被劃分為 U.linza 的同物異名)［2］和U.prolifera卻無(wú)法起到很好的辨別作用。為此我們采用了一個(gè)更加靈敏的分子標(biāo)記——5S rDNA間隔序列標(biāo)記，Shimada等人的研究證實(shí)了5S rDNA間隔區(qū)對(duì)于石莼屬中LPP分枝中滸苔和緣管滸苔的準(zhǔn)確劃分有著重要作用［19］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，5S rDNA間隔序列成功地將緣管滸苔和滸苔區(qū)分開(kāi)來(lái)，明確了本研究中采集的18株漂浮樣品均為滸苔U.prolifera，滸苔仍然是2010年—2011年間山東近海漂浮綠潮的優(yōu)勢(shì)種群。

綠潮的發(fā)生通常都是由一種或幾種石莼屬綠藻構(gòu)成，更好的對(duì)綠潮藻種類(lèi)組成進(jìn)行研究對(duì)于解決綠潮問(wèn)題至關(guān)重要。在本研究中，我們采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)2010年—2011年山東近海黃海海域綠潮藻的種類(lèi)進(jìn)行了鑒定。通過(guò)ITS和rbcL的序列分析，我們發(fā)現(xiàn)從山東近海19個(gè)不同地點(diǎn)收集的31株石莼屬樣品可以劃分為3個(gè)不同的分枝:LPP分枝、孔石莼分枝和扁滸苔分枝，固著藻和漂浮藻樣品中均有孔石莼的存在。為確定LPP分枝中18株漂浮藻的最終分類(lèi)地位，我們進(jìn)一步進(jìn)行了5S rDNA間隔序列的序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18株漂浮藻均為滸苔U.prolifera。因此，2010年—2011山東近海綠潮種類(lèi)組成包括滸苔 U.prolifera、孔石莼 U.pertusa和扁滸苔 U.compressa。本研究表明多種石莼屬綠藻共同構(gòu)成了2010年—2011年山東近海的綠潮災(zāi)害，其不同種類(lèi)所占比例也有所不同，該結(jié)果為進(jìn)一步查明山東近海綠潮來(lái)源提供了重要信息。綠潮藻種類(lèi)組成對(duì)于綠潮發(fā)生發(fā)展起到何種作用尚需進(jìn)一步研究。

為查明本國(guó)石莼屬資源，防范外來(lái)有害生物或綠潮災(zāi)害的發(fā)生，一些發(fā)達(dá)國(guó)家，如新西蘭［15］、日本［19］等已經(jīng)對(duì)其周邊海域內(nèi)石莼屬綠藻進(jìn)行了詳盡的調(diào)查與分析，明確了具體種類(lèi)。石莼屬綠藻迄今全世界已報(bào)道種類(lèi)約有100種［2］，但中國(guó)有文獻(xiàn)報(bào)道記載的石莼屬綠藻種類(lèi)僅有10余種［14］。中國(guó)海岸線(xiàn)遼闊，氣候多變，地理跨度大，海洋資源對(duì)國(guó)家發(fā)展意義重大，很有必要開(kāi)展石莼屬綠藻資源調(diào)查工作。

［1］Hayden H，Blomster J，Maggs C，et al.Linnaeus was right all along:Ulva and Enteromorpha are not distinct genera［J］.European Journal of Phycology，2003，38:277-294.

［2］Guiry M D，Guiry G M.Algae base.world-wide electronic publication，National University of Ireland，Galway.http://www.algaebase.org;searched on 14 February 2012.

［3］李 杰.青島滸苔變身紀(jì)念品［N］.中國(guó)海洋報(bào)，20080822期，http://epaper.oceanol.com/shtml/zghyb/20080822/56946.shtml.

［4］王秋蓉，唐少曼.青島打撈滸苔超過(guò)18萬(wàn)噸［N］.中國(guó)海洋報(bào)，20080704期，http://epaper.oceanol.com/zghyb/20080704/index.htm.

［5］唐少曼.黃海滸苔陸續(xù)在威海、煙臺(tái)和青島登岸［N］.中國(guó)海洋報(bào)，20090724 期，http://epaper.oceanol.com/shtml/zghyb/20090724/61771.shtml.

［6］國(guó)家海洋局.2010年中國(guó)海洋災(zāi)害公報(bào)［R］.2011，http://www.soa.gov.cn/soa/hygbml/zhgb/ten/webinfo/2011/04/1303019794623623.htm.

［7］國(guó)家海洋局.2011年中國(guó)海洋災(zāi)害公報(bào)［R］.2012，http://www.soa.gov.cn/soa/hygbml/zhgb/eleve/webinfo/2012/07/1341188579657459.htm.

［8］牛建峰，范曉蕾，潘光華，等.青島海域大面積聚集漂浮滸苔的顯微觀測(cè)［J］.海洋科學(xué)，2008，32(8):30-33.

［9］Leliaert F，Zhang X，Ye N，et al.Research note:identity of the Qingdao algal bloom［J］.Phycological Research，2009，57(2):147-151.

［10］Hiraoka M，Ichihara K，Zhu W，et al.Culture and hybridization experiments on an Ulva clade including the Qingdao strain blooming in the Yellow sea［J］.PLoS ONE，2011，6(5):e19371.

［11］Kim J H，Kang E J，Park M G，et al.Effects of temperature and irradiance on photosynthesis and growth of a green-tide-forming species(Ulva linza)in the Yellow Sea［J］.Journal of Applied Phycology，2011，23(3):421-432.

［12］Duan W，Guo L，Sun D，et al.Morphological and molecular characterization of free-floating and attached green macroalgae Ulva spp.in the Yellow Sea of China［J］.Journal of Applied Phycology，2012，24(1):97-108.

［13］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28:2731-2739.

［14］Tseng C K.Common seaweeds in China［M］.1983，Beijing:Science Press.

［15］Heesch S，Broom J E S，Neill K F，et al.Ulva，Umbraulva and Gemina:genetic survey of New Zealand taxa reveals diversity and introduced species［J］.European Journal of Phycology，2009，44(2):143-154.

［16］Heesch S，Broom J，Neill K，et al.Genetic diversity and possible origins of New Zealand populations of Ulva［R］.Biosecurity New Zealand Technical Paper No:2007/01，2007.

［17］Aguilar-Rosas R，Aguilar-Rosas L E，Shimada S.First record of Ulva pertusa Kjellman(Ulvales，Chlorophyta)in the Pacific Coast of Mexico［J］.Algae，2008，23(3):201-207.

［18］Blomster J，Maggs C A，Stanhope M J.Molecular and morphological analysis of Enteromorpha intestinalis and E.compressa(Chlorophyta)in the British Isles［J］.Journal of Phycology，1998，34(2):319-340.

［19］Shimada S，Yokoyama N，Arai S，et al.Phylogeography of the genus Ulva(Ulvophyceae，Chlorophyta)，with special reference to the Japanese freshwater and brackish taxa［J］.Journal of Applied Phycology，2008，20(5):979-989.