程娜娜，劉福霞，馬愛珍，韓 榕

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾041004)

隨著人類社會的不斷進(jìn)步，工業(yè)化進(jìn)程的快速發(fā)展，人類對大自然的影響日趨頻繁，與此同時(shí)對大氣環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞。大量污染物如氯氟烴、氯氣、硫化物、NO和N02被不加處理地排放到大氣中，對臭氧層造成一定的破壞［1］。大氣臭氧層遭到破壞，導(dǎo)致到達(dá)地表的中波紫外線(即紫外線B，UV-B)輻射增強(qiáng)，并有持續(xù)增強(qiáng)的趨勢［2-4］。由三個(gè)氧原子組成的臭氧(O3)雖然在大氣中所占比例很小，卻是重要的微量氣體。由于O3可吸收大量的紫外線輻射，因此平流層和對流層的溫度在很大程度上是由O3決定的［5］。近年來由于臭氧層的破壞，使得到達(dá)地面的UV-B輻射逐漸增強(qiáng)，因此對人類的健康以及動植物的生長發(fā)育都產(chǎn)生了極大的威脅。因此研究增強(qiáng)UV-B輻射對植物的影響成了近幾年的熱點(diǎn)［6］。

韓榕等［7］在研究增強(qiáng)UV-B輻射對小麥細(xì)胞染色體畸變及分裂的影響的研究中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的體細(xì)胞分裂方式“分束分裂”。微管骨架均勻分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，結(jié)構(gòu)完整;發(fā)生“分束分裂”現(xiàn)象的小麥根尖細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)被破壞，在細(xì)胞中分布極不均勻。因此，經(jīng)增強(qiáng)的UV-B輻射后，細(xì)胞骨架體系會發(fā)生較大差異。而在有絲分裂過程中微管是形成紡錘體的主要成分，染色體的分離是通過紡錘體的牽拉發(fā)生的。因此，推測“分束分裂”的發(fā)生可能與微管結(jié)構(gòu)、形態(tài)及組成有關(guān)。微管是所有真核生物細(xì)胞骨架的重要成分。微管主要由微管蛋白α、β亞基聚合形成直徑為25 nm的中空管狀結(jié)構(gòu)［8］。微管兩端的動態(tài)變化表現(xiàn)在微管踏車現(xiàn)象［9］。微管參與細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生和維持、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等過程［10］。本文初步以擬南芥為材料，研究了增強(qiáng)UV-B輻射對其葉片微管蛋白的影響，以期探討微管蛋白在增強(qiáng)UV-B輻射后的植物中所發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

哥倫比亞生態(tài)型(Columbia-0)擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 材料培養(yǎng)

擬南芥種子4℃避光春化2～3 d。然后用1.5%次氯酸鈉消毒3-5次，并用無菌水漂洗干凈，加入0.1%的瓊脂水使種子懸浮后用移液槍點(diǎn)種在MS培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度(20±2)℃，濕度60%-80%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.3 UV-B輻射處理

擬南芥在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)17 d后，移栽到蛭石及珍珠巖的小花盆中蓋膜培養(yǎng)5 d，揭膜后7、8、9、10 d分別進(jìn)行UV-B處理。UV-B處理用UV-B燈，將其垂直懸于花盆上方，采用不同的輻射劑量(12.96 KJ·m-2·d-1、17.28 KJ·m-2·d-1、21.60 KJ·m-2·d-1)處理8 h。輻射處理后立即轉(zhuǎn)入暗處25℃培養(yǎng)。未經(jīng)UV-B處理的植株作為對照［11］，次日上午取材。

1.4 擬南芥葉片微管蛋白提取

提取方法參照郭愛華等［12］，并略有改動。

稱取擬南芥葉片0.1 g，在研缽中加入少量石英砂及適量微管蛋白提取緩沖液(50 mM PIPES-KOH，2 mM MgCl2，2 mM EGTA，1 mM DTT，1 mM PMSF，50 μg/mL TPCK，50 μg/mL TAME，pH 值 6.9)，冰浴充分研磨，用超高速離心機(jī)(100000 r/min，4℃，20 min)，取上清。

1.5 微管蛋白含量的測定

參考李合生［13］方法，略有改動。

取樣品提取液20 μL，加入蒸餾水 980 μL，使總體積為1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混勻，放置2 min，在595 nm下比色，測定吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)的含量。樣品中蛋白質(zhì)的含量計(jì)算公式:

C——查得的標(biāo)準(zhǔn)曲線值，μg;VT——提取液總體積，mL;

VS——測定時(shí)加樣量，mL;WF——樣品鮮重，g 。

1.6 SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印跡

1.6.1 SDS-PAGE凝膠電泳

采用SDS-PAGE凝膠電泳，垂直平板電泳槽，制備厚度為1.5 mm的膠，并采用5%的濃縮膠和12.5%的分離膠。上樣前在蛋白溶液中按1：1(v/v)加入上樣緩沖液，沸水中熱處理3～5 min，樣品上樣量為20 μL。

1.6.2 免疫印跡

參考章靜波［14］方法，略有改動。

切膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30 min，轉(zhuǎn)膜過程中根據(jù)膜大小選擇電壓(小于25 V)，轉(zhuǎn)膜30 min，取出膜后TBST洗3次，麗春紅染色，看到條帶后用蒸餾水洗膜至完全褪色，封閉1 h，TBST洗膜3次，加一抗(sigma產(chǎn)品)過夜孵育，TBST洗膜3次，加二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL試劑盒顯影(以Rubisco蛋白作為內(nèi)參蛋白)。

1.7 圖像采集及數(shù)據(jù)分析

使用凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像。使用spss17.0軟件分析數(shù)據(jù)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較差異的顯著性。利用Quantity One凝膠軟件對SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增強(qiáng)UV-B輻射后擬南芥7、8、9、10日齡微管蛋白含量變化

圖1 不同處理組對不同日齡擬南芥葉片蛋白含量的影響Fig 1 The effects of different treatment on protein content in different day age Arabidopsis thaliana leaves

由圖1可以看出，經(jīng)過UV-B輻射處理后7、8、9日齡擬南芥中微管蛋白含量都表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢。9日齡含量最高，變化也最為顯著。而10日齡的含量雖高于9日齡但UV-B輻射后變化規(guī)律為先增加后減少并處于緩慢變化狀態(tài)，所以確定9日齡為最佳研究材料。

2.2 擬南芥微管蛋白的含量

由圖2可以看出，9日齡擬南芥對照組及不同UVB輻射(B1、B2、B3組)處理組蛋白含量變化，不同UVB輻射劑量對擬南芥葉片微管蛋白造成不同程度的影響。與對照組相比，B1、B2組蛋白含量分別增加6.00%、6.82%(P＜0.05)，且差異顯著;與對照組相比，B3組蛋白含量下降2.72%(P＞0.05)，但差異不顯著。與B1組相比，B2組蛋白含量僅增加0.88%(P＞0.05)，差異不顯著;與B1組相比，B3組蛋白含量明顯減少8.49%(P＜0.05)，差異顯著，且低于對照組。與B2組相比，B3組蛋白含量也明顯減少9.29%(P＜0.05)，且差異顯著。

圖2 不同處理組擬南芥葉片微管蛋白的含量變化Fig 2 The content change of tubulin in Arabidopsis thaliana leaves with different treatment

2.3 擬南芥微管蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖3為對照組和不同UV-B處理組擬南芥葉片微管蛋白的電泳圖譜，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，從上到下依次為 170、130、95、72、55、43、34、26、17 和 10 KD，通常純化的微管蛋白應(yīng)當(dāng)是a、β亞基以1：1二聚體存在，其分子量為110 KD［15］，但利用 Quantity One軟件對電泳圖譜分析得到的分子量為53 KD，推測可能是由于非共價(jià)鍵破壞導(dǎo)致微管蛋白解聚，此時(shí)電泳圖譜中為單體的分子量。經(jīng)Western-Blot鑒定電泳圖譜中為目的條帶(圖A)。圖4為不同處理組內(nèi)參蛋白Rubisco蛋白的含量，與CK組相比，B1、B2的蛋白含量分別增加0.02%、0.23%(P＜0.1)，B3的蛋白含量降低0.19%(P＜0.1)，差異不顯著，因此可以證明本次實(shí)驗(yàn)中上樣量基本相同，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無較大影響。由圖5可以看出，通過Quantity One軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度分析，以CK組為1作對照，其他處理組與CK組的比值則為其相對含量。與對照組相比，經(jīng)UV-B輻射的處理組 B1、B2的蛋白含量分別顯著增加6.85%和9.30%(P＜0.05)，B2最為明顯;但隨著輻射劑量的增加，B3組分別低于 B1、B2組12.74%、14.70%(P＜0.05)，且低于對照組6.76%(P＜0.05)。另外，從電泳圖譜分析B3組與其他組相比，大部分條帶消失(圖3，B)。

圖5 不同處理組擬南芥葉片微管蛋白相對含量的變化Fig 5 Changes in the relative content of tubulin in Arabidopsis thaliana leaves with different treatment

3 討論

與動物微管相比，植物微管的研究相對比較落后，主要原因就是難以從植物細(xì)胞中提取微管蛋白。Morejohn等首次從玉米、煙草、胡蘿卜、玫瑰懸浮細(xì)胞中分離純化得到微管蛋白，并體外聚合成功［15］。Sutherland等報(bào)道大豆葉片內(nèi)的環(huán)丁嘧啶二聚體率在UVB輻射后會增加，認(rèn)為高劑量的UV-B輻射能誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的二聚體(DNA損傷)，說明高劑量UV-B輻射會破壞其遺傳代謝體系［6］。高素娟等［16］的研究表明，體內(nèi)外有許多因素調(diào)控微管組織，其中光是一種對微管有多重調(diào)控作用的影響因素。

在受到脅迫時(shí)，包括化學(xué)試劑及環(huán)境脅迫，體內(nèi)胞質(zhì)微管會迅速組裝或解聚［17］。郭愛華等［18］研究表明，增強(qiáng)UV-B輻射后，小麥葉片中的微管骨架發(fā)生了解聚，形成短棒狀或點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，微管束呈彌散分布狀態(tài)且熒光強(qiáng)度減弱。安旭亮等［19］研究表明，在增強(qiáng)UV-B輻射后，小麥幼苗的Rop GTPase含量會降低，LCSM掃描細(xì)胞原生質(zhì)體顯示原生質(zhì)體的形狀發(fā)生了改變，同時(shí)細(xì)胞骨架也被破壞，標(biāo)記后的原生質(zhì)體熒光變暗，強(qiáng)度減弱。本實(shí)驗(yàn)使用不同劑量UV-B輻射處理不同日齡的擬南芥，并對葉片微管蛋白進(jìn)行提取，在對微管蛋白濃度進(jìn)行測定時(shí)，選用考馬斯亮藍(lán)法。采用最常用的SDS-PAGE及Western Blot鑒定微管蛋白。

微管骨架主要由微管蛋白和微管結(jié)合蛋白組成，并且通過其亞單位不斷延伸和縮短改變它的存在狀態(tài)。微管通過改變其存在狀態(tài)維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞運(yùn)動等，在植物中發(fā)揮著重要作用［20］。本文選取 7、8、9、10日齡的擬南芥幼苗進(jìn)行輻射，7、8、9日齡的幼苗中微管蛋白在三種不同UV-B輻射劑量下都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，可能是由于低劑量輻射后，幼苗中微管發(fā)生了解聚，使體系中的微管蛋白的單體含量增加，從而測得的微管蛋白的含量增加，微管解聚可能是擬南芥幼苗在低劑量的輻射下形成的自我保護(hù)功能，然而在高劑量UV-B輻射下，擬南芥幼苗的自我保護(hù)不足以抵抗其造成的損傷，因此，可能是微管發(fā)生聚合，從而使測得的體系中微管蛋白的含量減少。而10日齡幼苗微管蛋白含量的變化趨勢不同于7、8、9日齡的變化趨勢可能是由于隨著輻射天數(shù)的增加，在高劑量UV-B輻射下擬南芥幼苗自我保護(hù)功能已失去作用，一部分微管聚合后，幼苗趨于死亡，不再發(fā)生變化，因此在體系中測得的微管蛋白含量處于緩慢變化狀態(tài)。

增強(qiáng)UV-B輻射后，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與郭愛華［18］的微管蛋白含量變化趨勢一致，郭愛華的UV-B劑量為10.08 KJ·m-2·d-1，本文采取三種不同的UV-B劑量對9日齡的擬南芥葉片進(jìn)行輻射，在低劑量(12.96 KJ·m-2·d-1)和中劑量(17.28 KJ·m-2·d-1)UV-B輻射處理時(shí)，微管蛋白含量逐漸增加。高劑量(21.6 KJ·m-2·d-1)UV-B輻射處理時(shí)，微管蛋白含量明顯降低。隨著UV-B脅迫程度的增強(qiáng)，擬南芥葉片微管蛋白含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這表明，本文所施加的低劑量和中劑量的UV-B輻射使微管解聚，考馬斯亮藍(lán)法測含量的體系中微管解聚形成大量單體，從而使測得的蛋白含量增加，這與電泳圖譜得出的結(jié)論一致。然而，高劑量的UV-B輻射使考馬斯亮藍(lán)法測得的蛋白含量明顯下降，從電泳圖譜可以看出，微管蛋白單體含量也明顯減少，并且大部分的蛋白條帶消失，說明高劑量(21.6 KJ·m-2·d-1)UV-B輻射對植物是致死的。在增強(qiáng)UV-B輻射后，蛋白含量的增減，取決于輻射強(qiáng)度和植物對UV-B輻射的敏感程度差異。關(guān)于增強(qiáng)UV-B輻射如何影響擬南芥葉片微管蛋白還有待進(jìn)一步研究。

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