雷世勇，丁理法，黃福勇，竺俊全

(1.寧波大學(xué)教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室，寧波315211;2.溫嶺市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江溫嶺317500)

可口革囊星蟲(Phascolosoma esculenta)屬星蟲動物門、革囊星蟲科、革囊星蟲屬，自然分布于浙江、福建、廣東、廣西和海南等省沿海?？煽诟锬倚窍x棲息于潮間帶泥質(zhì)或泥沙質(zhì)灘涂，營穴居生活，以底棲硅藻和有機腐殖質(zhì)為食。由于其風(fēng)味獨特、營養(yǎng)經(jīng)濟價值及藥用價值較高［1-3］，且生長快、利用自然苗種養(yǎng)殖一年便能收獲，因此，是非常理想的優(yōu)良增養(yǎng)殖種。近年來由于沿海環(huán)境污染的加劇以及過度采捕，加之大面積灘涂被圍墾，減少了星蟲的棲息地，造成資源的嚴(yán)重衰退。因此，可口革囊星蟲的資源保護(hù)、人工育苗與增養(yǎng)殖引起重視［4］。迄今，有關(guān)可口革囊星蟲的基礎(chǔ)研究已經(jīng)涉及到了營養(yǎng)學(xué)［2，3］、繁殖生物學(xué)［5-9］、分子生物學(xué)［10-12］等方面。同工酶技術(shù)作為一種成熟的實驗手段，已在動物的生化遺傳和遺傳多樣性等多方面的研究中得到廣泛應(yīng)用。本研究用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對可口革囊星蟲5種組織中的10種同工酶進(jìn)行了檢測分析，以了解可口革囊星蟲基因表達(dá)的特異性，為進(jìn)一步研究可口革囊星蟲的遺傳多樣性、各組織的生理機能以及種質(zhì)鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用可口革囊星蟲采自浙江省溫嶺市塢根鎮(zhèn)潮間帶灘涂，挑選活力好、健壯的成體，個體重2.5～3.5 g，每種同工酶檢測均取30條。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

活體解剖可口革囊星蟲，取吻、腸和體壁組織各0.3 g，收吻肌和腎管取全部，用生理鹽水清洗后，加重蒸水600 μL，4℃冰浴勻漿，移入離心管，15 000 r/min離心15 min，取上清液，按1：1的比例加入40%甘油和0.1%溴酚藍(lán)指示劑，用于電泳分析。

1.2.2 電泳、染色

同工酶電泳采用聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳法，分離膠濃度為6.7%，濃縮膠濃度為2.5%，電極緩沖液為Tris-甘氨酸(TG，pH值8.3);采用DYY-2C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，DYCZ-24D型垂直板電泳槽;用25 μL微量進(jìn)樣器點樣，每空點樣量為15 μL，然后，將電泳槽移至4℃冰箱中進(jìn)行電泳。電泳時，指示劑在濃縮膠內(nèi)時用150 V電壓，當(dāng)指示劑完全進(jìn)入分離膠后，將電壓升高到180 V，總電泳時間約4 h。凝膠制備及染色參照文獻(xiàn)［13］。

1.2.3 結(jié)果記錄與酶譜分析

凝膠用7%醋酸溶液脫色固定后進(jìn)行酶譜分析，利用FR復(fù)日紫外/可見光分析生物凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，對凝膠測量后按酶帶遷移率手工記錄。各位點命名以各酶譜的相對Rf遷移率由小到大依次命名，即向陽極運動的酶譜帶開始依次命名為1，2，3……，Rf=l/L，l為陰極端至各譜帶中點的距離，L為陰極端至指示劑終點的距離。

2 結(jié)果

5種組織中的同工酶譜及活性強弱見圖1及表1。

2.1 醇脫氫酶(ADH，E.C.1.1.1.1)

腸組織中沒有檢測到有活性的ADH同工酶酶帶;吻中ADH同工酶由4個基因座位編碼，ADH-1活性較強，ADH-2、ADH-3、ADH-4活性較弱;ADH-1在收吻肌、吻、腎、體壁中均表達(dá)且活性較強;ADH-2只在體壁中表達(dá)、活性較弱。

2.2 D-葡糖脫氫酶(GCDH，E.C.1.1.1.118)

GCDH同工酶在收吻肌中有1條譜帶，活性很強;在吻中有5條譜帶;在腸中不顯示有活性的譜帶;在腎管中只有1條譜帶，活性弱;體壁中有2條譜帶。

2.3 山梨醇脫氫酶(SDH，E.C.1.1.1.14)

SDH同工酶在收吻肌中顯示有SDH-1、SDH-2兩條譜帶，在其它4種組織中只有一條譜帶。SDH-2在腸中酶活性強。

2.4 酯酶(EST，E.C.3.1.1.1)

EST同工酶酶譜較復(fù)雜，在5種組織中均有表達(dá)。EST-1僅在收吻肌中表達(dá)，活性強;EST-2在收吻肌、吻及體壁中表達(dá)，收吻肌中活性強;EST-3在5種組織中均有表達(dá)，腸與腎中活性強;EST-4只在腎管中表達(dá)，活性強;EST-5在腸和體壁中表達(dá)，活性強;EST-6和EST-7在吻和腸中表達(dá)，吻中活性弱、腸中活性強;EST-8和EST-9在吻和體壁中表達(dá)，且EST-9的活性強;EST-10只在吻中表達(dá)，活性強;EST-11在除腎管外的4種組織中均有表達(dá)，活性弱;EST-12在收吻肌、吻和腸中表達(dá)活性較弱。

圖1 可口革囊星蟲同工酶電泳圖譜Fig 1 Electrophoretic patterns of isozymes on Phascolosoma esculenta

2.5 乳酸脫氫酶(LDH，E.C.1.1.1.27)

LDH同工酶在收吻肌中僅有LDH-1和LDH-4兩條酶帶，LDH-1活性強;在吻中有5條酶帶，LDH-4活性強;在腸和腎管中只有LDH-4一條酶帶，且活性弱;體壁中有4條酶帶，LDH-4活性強。

表1 可口革囊星蟲5種組織中9種同工酶的表達(dá)和活性Table 1 The expression and activity of 9 isozymes in 5 tissues of Phascolosoma esculenta

2.6 蘋果酸酶(ME，E.C.1.1.1.40)

ME同工酶具有復(fù)雜而清晰的酶譜。ME-1僅在吻中存在;ME-2、ME-3和 ME-4在5種組織中均存在，ME-2在收吻肌、吻及體壁中活性強，而在腸和腎管中活性較弱，ME-3、ME-4在5種組織中活性強;ME-5和ME-6僅在吻和體壁表達(dá)。

2.7 過氧化物酶(POD，E.C.1.11.1.7)

過氧化物酶共有2條酶帶，其中POD-1僅在吻中表達(dá)，但活性較弱;POD-2在吻、腸、腎管及體壁中表達(dá)，腸和腎管中活性較強。

2.8 超氧化物歧化酶(SOD，E.C.1.15.1.1)

SOD同工酶僅有一條酶帶，SOD酶帶在5種組織中均有表達(dá)，在收吻肌中活性弱，在其它組織中活性強。

2.9 蘋果酸脫氫酶(MDH，E.C.1.1.1.37)

MDH同工酶有電泳移動較快的s(胞質(zhì)型)-MDH和移動較慢的m(線粒體型)-MDH兩種類型，m-MDH靠近陰極，s-MDH靠近陽極。m-MDH由一個基因座位編碼，s-MDH由s-MDH-1和s-MDH-2兩個基因座位編碼，互相之間不雜合，其中s-MDH-2在各組織中活性很強。

3 討論

在所檢測的10種同工酶中，除CAT沒有檢測到酶活性外，其它9種同工酶得到了相應(yīng)的酶譜。從圖1和表1可以看出，從同工酶酶譜的表型來看，SOD和MDH在各組織中的表型較為一致，SOD由一個基因座位編碼，在收吻肌中活性較弱，在其它4種組織中活性較強，MDH由3個基因座位編碼，3個基因座位(m-MDH、s-MDH-1和s-MDH-2)在5種組織中均有表達(dá)，除m-MDH在5種組織中的活性有差異外，s-MDH-1和s-MDH-2在5種組織中活性都很強。在可口革囊星蟲的5種組織中，SDH-2、EST-1、LDH-1及 POD-1為收吻肌所特有;ADH-3、ADH-4、GCDH-2、GCDH-4、GCDH-5、EST-10及LDH-6為吻所特有;EST-4為腎管所特有;在腸中，ADH和GCDH均沒有檢測到活性。不同組織中同工酶表達(dá)的差異是受不同的遺傳基因控制的結(jié)果，以適應(yīng)各組織器官不同的生理需要。

同工酶在生物體各組織中的表達(dá)、分布及活性與各組織的生理機能密切相關(guān)。如酯酶和食物的消化有密切關(guān)系，同時還有解毒的作用［13］;醇脫氫酶、D-葡糖脫氫酶、山梨醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和蘋果酸酶和能量的產(chǎn)生有密切關(guān)系［14-17］;過氧化物酶和超氧化物歧化酶和機體的防御機能密切相關(guān)［18］。

可口革囊星蟲的5種組織具有較為豐富的酶系統(tǒng)，它們以同工酶的形式參與機體的代謝和調(diào)節(jié)。收吻肌的運動需要大量的能量，與此相適應(yīng)，收吻肌中D-葡糖脫氫酶、蘋果酸酶和蘋果酸脫氫酶表現(xiàn)出較強活性;吻中D-葡糖脫氫酶、酯酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸酶、超氧化物歧化酶和蘋果酸脫氫酶均有表達(dá)，且大多具有復(fù)雜酶譜并表現(xiàn)出較強活性，這不僅與吻作為星蟲動物重要運動器官、需要大量能量供應(yīng)相適應(yīng)，還說明它可能對攝取的食物進(jìn)行初步消化，并擔(dān)負(fù)著機體防御的功能;腸中，有些酯酶活性強，超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性較強，說明腸除了擔(dān)負(fù)消化功能之外，還起著解毒和防止氧化損傷等作用［14］;體壁運動耗能多，蘋果酸酶和蘋果酸脫氫酶活性強，因機體防御機能的需要，有些酯酶和超氧化物歧化酶活性也較強?？煽诟锬倚窍x為低等無脊椎動物，各組織功能的分化程度較低，收吻肌、吻及體壁在機體運動中相互配合，吻、腸、體壁同時在完成機體的防御功能中擔(dān)負(fù)重要使命，吻和腸還具有消化、吸收的功能，這從同工酶酶譜中得到了很好反映。

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