孫磊，宋雙，李輝，蘇冬梅

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.國家計生委科學技術研究所遺傳實驗室，北京 110081）

NODAL基因是最早的合子基因，它在哺乳動物的心臟發(fā)育中發(fā)揮了重要作用［1］。研究顯示，在與心臟發(fā)育密切相關轉錄因子CITED2缺失的小鼠胚胎中，伴隨著左側側板中胚層中信號轉導因子如PITX2C、EBAF、NODAL等表達明顯降低，進而造成心臟流道、房室間隔畸形等的產(chǎn)生［2］。本研究以中國人群為研究對象，通過檢測先心病和正常組織中NODAL基因表達變化，初步確定NODAL信號通路異常與先心病發(fā)生的關系，并通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)和免疫共沉淀實驗對SMAD2、CITED2（camp反應元件結合蛋白/p300結合轉化激活因子，含谷氨酸和天冬氨酸豐富羧基末端域）與NODAL基因之間相互作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑

TaKaRa RNAiso Reagent（日本TaKaRa公司）；逆轉錄試劑盒（美國Promega公司）；實驗室常用化學藥品（北京化學試劑公司）；引物（從北京英俊生物公司合成）；在質粒構建實驗過程中所需要使用的各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA Marker和普通PCR反應中的Premix ExTaq（日本TaKaRa公司）；熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司）；鼠抗 β-肌動蛋白抗體（美國 Sigma公司）；兔抗NODAL抗體（美國Abcam公司）；SuperSignala West Pico化學發(fā)光底物（美國Pierce公司）；兔抗CITED2抗體（美國Abcam公司）；兔抗SMAD2抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；Lipofectamine 2000試劑盒（美國Invitrogen公司）；二抗：辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（美國Pierce公司）；蛋白：兔IgG蛋白（北京中衫金橋生物技術有限公司）；H9C2細胞系（協(xié)和基礎醫(yī)學細胞中心）等。

1.2 實驗分組和心臟組織的處理

選取2009年10月至2011年10月在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院住院的超聲和解剖同時診斷的孕周為24～26周引產(chǎn)的先心病胎兒心臟組織16例為實驗組，并以同期同孕周因計劃外妊娠引產(chǎn)、難免流產(chǎn)等16例正常胎兒心臟組織為對照組（本試驗在孕婦及家屬簽署知情同意書和醫(yī)院倫理委員會同意下進行）。組織取出液氮速凍4 h后-80℃保存。

1.3 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）

1.3.1 逆轉錄（Reverse Transcription，RT）：逆轉錄使用Promega公司的Reverse Transcription System試劑盒進行，按照試劑盒說明書進行實驗。

1.3.2 熒光定量 PCR（Real-time PCR）：（1）Real-time PCR實驗使用ABI PRISM誖7000序列檢測系統(tǒng)（PE Applied Biosystems，美國）。PCR反應采用兩步法進行，反應條件為95℃60 s，然后95℃15 s和60℃60 s，持續(xù)40個循環(huán)，做3個復孔。所得結果的Ct值（threshold cycle）定義為達到超出熒光信號的檢測閾值時所需要的循環(huán)數(shù)；ΔCt值=目的基因Ct值-βactinCt值；ΔΔCt值=樣品組 ΔCt值-對照組 ΔCt值。所得的數(shù)據(jù)應用ABI公司（Applied Biosystems）所提供的軟件以2-ΔΔCt方法來計算。（2）引物及內(nèi)參：NODAL 基因引物序列為 sense，5′-GAGACATATGT GCATGTATTTTGGA-3′，antisense，5′-TGAGATTGAC GGACTCTTTTTAATC-3′。β-肌動蛋白（β-actin）的引物序列為：sense，5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′，antisense，5′-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3′。其中β-actin作為內(nèi)參。

1.4 蛋白免疫印跡

免疫印跡（Western blot）采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。將10～20 μL組織裂解物進行SDS-PAGE電泳；將蛋白樣品從SDS-PAGE凝膠轉移至PVDF膜，將轉移后的PVDF膜置于封閉液中，37℃封閉1 h；PBST洗膜3次，加入用抗體稀釋液稀釋為工作濃度的一抗（兔抗NODAL抗體1∶500，兔抗CITED2抗體1∶500，兔抗SMAD2抗體1∶300稀釋）4℃過夜孵育。PBST緩沖液中洗膜3次；加入用抗體稀釋液稀釋的辣根標記的二抗（1∶2 000稀釋），37℃輕輕搖動40 min，PBST緩沖液洗膜3次，加入發(fā)光底物反應5 min，曝光。

1.5 質粒構建、細胞培養(yǎng)，轉染和熒光素酶報告基因檢測

通過采用聚合酶鏈反應（PCR）擴增人類基因組DNA中NODAL啟動子區(qū)1個長794堿基的片段，將此片段克隆到兩端加酶切位點EcoRⅠ和KpnⅠ與熒光素酶報告 PGL3-basic載體連接，PGL3-NODAL質粒構建成功。SMAD2片段PCR擴增，插入XhoⅠ和HindⅢ雙酶切位點和GFP載體相連，pEGFP-SMAD2質粒構建成功。CITED2片段PCR擴增，插入HindⅢ和XhoⅠ雙酶切位點和pcDNA3-Flag載體相連，pcDNA3-Flag-CITED2質粒構建成功 。 H9C2 細 胞 在 Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）培養(yǎng)基（包含10%胎牛血清，青霉素100 mg/mL，鏈球菌100 mg/mL）在37°C含有5%CO2潮濕環(huán)境下培養(yǎng)。H9C2細胞瞬時轉染使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）試劑盒，檢測轉染細胞熒光素酶報告使用Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。將要檢測的SMAD2、CITED2表達質粒與報告基因質粒PGL3-NODAL質粒共轉染H9C2細胞。如果SMAD2和CITED2能夠激活NODAL基因啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

1.6 免疫共沉淀

免疫共沉淀在H9C2心肌細胞系中進行，SMAD2-GFP、Flag-CITED2和轉染細胞的總細胞提取物加入40 μL protein A瓊脂糖珠4°C孵育1 h，將40 μL protein A瓊脂糖珠加入到上清液中和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育3 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。免疫沉淀反應后，用100 μL 2×loading buffer將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起并煮沸10 min。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移至PVDF膜上和CITED2抗體 （Abcam）或者SMAD2抗體（Cell Signaling Technology）做免疫檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 室間隔缺損心臟組織中的NODAL基因的表達降低

NODAL mRNA表達水平的RT-PCR分析結果（圖1）：NODAL mRNA在室間隔缺損心臟組織較對照組的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.01）。見圖1A。

圖1 室間隔缺損心臟組織NODAL基因表達降低Fig.1 Down-regulation of NODAL in the cardiac tissues from patientswith VSDs

NODAL蛋白質表達水平的Western blot分析結果：室間隔缺損心臟組織中可檢測出NODAL蛋白質，并且在室間隔缺損中表達量明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.01）（圖1B）。

2.2 Smad2、Cited2能夠上調NODAL基因表達，激活NODAL基因啟動子

熒光素酶報告基因檢測實驗發(fā)現(xiàn)SMAD2和CITED2分別能上調NODAL基因表達。CITED2和SMAD2同時表達時NODAL基因的啟動子活性呈4.3倍上調，SMAD2和轉錄輔因子CITED2協(xié)同調控NODAL基因表達。因此推測CITED2作為轉錄因子SMAD2轉錄輔因子共同調控NODAL基因的表達，（圖2）。

圖2 熒光素酶報告基因檢測Cited2和Smad2協(xié)同調控NODAL基因表達Fig.2 Luciferase reporter gene assay experimental results：CITED2functions co-operatively with SMAD2 for expressionof NODAL gene

2.3 CITED2、SMAD2存在于同一轉錄復合物中

熒光素酶報告基因檢測表明SMAD2和轉錄輔因子CITED2協(xié)同調控NODAL基因表達。同時本研究采用了免疫共沉淀實驗來探討是否存在兩個轉錄調節(jié)因子之間的相互作用。在免疫共沉淀實驗中，H9C2細胞和SMAD2-GFP表達載體共同轉染，加入抗GFP抗體進行免疫沉淀，沉淀的蛋白質和CITED2抗體進行免疫印跡檢測（圖3A）。同時H9C2細胞和Flag-CITED2表達載體共同轉染，加入抗Flag抗體進行免疫沉淀，沉淀的蛋白質和SMAD2抗體進行免疫印跡檢測（圖3B）。通過免疫共沉淀實驗表明CITED2和SMAD2存在于同一轉錄復合物中共同調控NODAL基因的表達。

圖3 CITED2和SMAD2免疫共沉淀實驗結果Fig.3 Co-IP assays results of CITED2 and SMAD2

3 討論

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是指胎兒時期心臟、血管發(fā)育障礙所導致的形態(tài)、結構和功能異常的一組先天畸形，是一類常見的危害嬰幼兒健康的疾病，其在新生兒中的發(fā)病率約為1%［3，4］。 隨著全球患病率逐年增長，CHD已引起廣大學者和臨床醫(yī)生的高度重視，CHD病因學的研究對提高出生人口質量、降低出生人口病死率具有重大意義。室間隔缺損是常見的CHD之一［5］，胚胎期遺傳因素和環(huán)境因素在其形成中扮演著重要的角色。但這種心臟缺陷形成的確切的分子生物學機制目前依然不明。

最新研究揭示了大量CHD的致病和易患基因［6，7］，心臟特異轉錄因子是其中的一部分，主要指的是在心肌細胞中表達并調控編碼心肌細胞結構蛋白或調節(jié)心臟基因蛋白表達的關鍵的轉錄活化因子［8，9］。轉錄共激活因子CITED2是轉錄激活因子家族中的新成員，通過乙?；M蛋白和p300同源蛋白質來控制其他轉錄因子的活性，從而調控相關基因的表達，其活性異?？梢鹨恍┘膊?。CITED2和SMAD2被形容為心臟特異性基因表達的重要調節(jié)基因。敲除掉CITED2的小鼠表現(xiàn)為各種心臟畸形，包括心房和心室間隔缺損，右側主動脈弓，右心室雙出口，共同動脈干和主動脈騎跨［10］。信號傳導蛋白SMAD2基因其磷酸化不利于心臟的正常發(fā)育［13，14］，SMAD2的異常磷酸化也可引起心臟發(fā)育異常。有研究顯示在散發(fā)的先心病患者中存在CITED2和SMAD2基因突變，其中CITED2基因突變也在少量室間隔缺損病例中被發(fā)現(xiàn)［11，12］。本研究中熒光素酶報告檢測分析和免疫共沉淀實驗的結果表明CITED2、SMAD2存在于同一轉錄復合物中共同調控NODAL基因的表達。本研究還發(fā)現(xiàn)室間隔缺損心臟組織中的NODAL基因的表達降低。

本研究通過病變組織的研究確定了NODAL信號異常表達很可能是人類室間隔缺損發(fā)生的原因之一，為先心病的診斷、治療、預防、預后及風險預測提供了一定的科學理論依據(jù)。同時還發(fā)現(xiàn)SMAD2和CITED2分別能調節(jié)NODAL基因的表達，CITED2、SMAD2可能存在于同一轉錄復合物中共同調控NODAL基因的表達。綜上所述我們可以推測：CITED2和SMAD2基因突變導致心臟畸形的原因可能是由于NODAL信號通路缺陷所致。

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