何桂林，邵冬雪，印丹丹，胡慧媛，郭鳳，王紅梅，郝麗英

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽(yáng) 110001；2.江西省人民醫(yī)院藥劑科，南昌 320006）

細(xì)胞外鈣內(nèi)流在肌肉收縮、腺體分泌、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及遞質(zhì)釋放等生理過(guò)程中起著非常重要的作用［1，2］。心肌細(xì)胞中，細(xì)胞外鈣內(nèi)流主要通過(guò) L-型鈣通道。L-型鈣通道C末端的多個(gè)序列、N末端以及Ⅰ-Ⅱ片段可與多種調(diào)節(jié)因子相互作用而調(diào)節(jié)通道活性［2～4］，其中C末端的CT1序列是與CaM、CaMKⅡ、Calpastatin等多種調(diào)節(jié)因子相互作用的共同序列［5～7］。CaM是一種廣泛存在于生物體的鈣結(jié)合蛋白，是細(xì)胞內(nèi)鈣的重要受體，參與細(xì)胞中多種酶和生理過(guò)程的調(diào)節(jié)［8］，與Ca2+形成Ca2+/CaM復(fù)合物而發(fā)揮生理學(xué)功能［9］。鈣通道蛋白分離純化方法較多［4，10，11］，但 CaV1.2 鈣通道蛋白中的 CT1 片段因難溶于水而較難純化［12］。本研究改進(jìn)完善了CaV1.2鈣通道C末端CT1、CT2和CT3的分離純化，并利用GST pull-down assay實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討了CT1、CT2和CT3與CaM及突變體的結(jié)合。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6p-3/CaM、pGEX-6p-3/CaM12 （E31A+E67A）、pGEX-6p-3/CaM34 （S101F+E140A）、pGEX-6p-3/CaM1234（E31A+E67A+S101F+E140A）質(zhì)粒均由日本鹿兒島大學(xué)Kameyama教授惠贈(zèng)；pGEX-6p-3/CT1、pGEX-6p-3/CT2和pGEX-6p-3/CT3由生工生物工程（上海）有限公司制作；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、溶菌酶、AMP均購(gòu)自Sigma公司；PreScission Protease 與 Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）購(gòu)自GE Healthcare公司。其他試劑均購(gòu)自BIOSHARP公司。

1.2 方法

1.2.1 重組菌株培養(yǎng)及 GST-CT1、GST-CT2、GSTCT3表達(dá)：將CaV1.2 C-末端的3個(gè)融合蛋白（CT1，a.a.1509-1789；CT2，a.a.1778-2003；CT3，a.a.1942-2169，圖1）相對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）中，挑取單克隆菌落于5 mL LB/Amp+培養(yǎng)液中，37°C振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（A595=0.6～1.0），保留菌種［13］。取適量菌種加入裝有400 mL LB（含AMP 50 μg/mL）培養(yǎng)液的錐形瓶中，37 °C、120 r/min 震搖培養(yǎng)12～16 h。當(dāng)A595值在0.6～1.0之間時(shí)，加入IPTG 至 1 mmol/L，37 °C、120 r/min 震搖培養(yǎng) 4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

圖1 CaV1.2、CaM及其突變體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of fragment peptides of CaV1.2，CaMand its mutants

1.2.2 CT1、CT2、CT3的提取與純化：所有操作均在冰上進(jìn)行，所有離心均為4°C離心。菌液離心（6 000 r/min，10 min），棄上清，用含 1.5%N-lauroylsarcosine sodium salt（Sigma公司）PBS重懸沉淀菌體，冰浴30 min；超聲打破細(xì)菌，超聲3 s停 3 s，200 W，20 min；加入 Triton X-100 至1%，冰浴 30 min；16 000 r/min離心 10 min，將上清轉(zhuǎn)移至2個(gè)15 mL離心管中，每個(gè)離心管中加有500 μL GS-4B beads（預(yù)先各管每次用5 mL PBS洗2次），置旋轉(zhuǎn)混合器充分混合4 h（10 r/min）。600 r/min離心3 min，棄上清。各管加入5 mL PBS，600 r/min離心3 min，棄上清，洗3～5次。每個(gè)管中加入1 000 μL Tris buffer（50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaCl），4°C保存。參照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒方法測(cè)定純化后的GST-CT1、GST-CT2和GSTCT3的濃度，使其濃度約為0.04 g/L。

1.2.3 CT1、CT2、CT3蛋白鑒定：取連接于beads上的 CT1（CT2 或 CT3）50 μL，600 r/min，3 min，棄上清。加入10 μL 5×SDS洗脫連于beads上的目的蛋白，100°C 煮 10 min，離心，上清行 15%SDS-PAGE電泳，檢測(cè) CT1、CT2、CT3 蛋白。

1.2.4 CaM、CaM12、CaM34和 CaM1234分離純化：CaM12是CaM的N-lobe 2個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，失去與鈣離子結(jié)合能力；CaM34是CaM的C-lobe 2個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變；CaM1234是CaM兩端的鈣結(jié)合位點(diǎn)均發(fā)生突變（圖1）。CaM及突變體蛋白的分離純化參照文獻(xiàn)［13］。

1.2.5 GST pull-down assay 分別觀察 CT1、CT2、CT3與CaM及突變體的相互作用：取連接于beads上的CT1（CT2或 CT3）50 μL于 1.5 mL EP管中，加入CaM （終濃度分別為0.1、0.35、0.7、1.4、2.1、3.5 μmol/L）、CaCl220 μL （［Ca2+］2 mmol/L）、Tris buffer至1 mL。將1.5 mL EP放于旋轉(zhuǎn)混合器上，10 r/min，4 °C，4 h。600 r/min，3 min，棄上清。加入 1 mL Tris buffer輕輕混勻，600 r/min，3 min，棄上清（輕洗2遍）。加入 15 μL 5×SDS洗脫。600 r/min，3 min，上清用15%SDS-PAGE電泳確認(rèn)。SDS-PAGE膠上的蛋白帶通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色顯示，并采用Photoshop軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析：總量［CaMs］—結(jié)合［CaMs］的關(guān)系曲線用SigmaPlot 10.0軟件中的Hill公式進(jìn)行擬合，其擬合公式如下

其中Bmax為最大結(jié)合量，X為游離配體濃度，Kd為表觀分離常數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中的游離CaM濃度接近于CaM總濃度，所以X即為CaM總濃度。

2 結(jié)果

2.1 GST-CT1、GST-CT2、GST-CT3 與 CaM 的相互結(jié)合作用結(jié)果

CaV1.2 C-末端的3個(gè)融合蛋白片段：GST-CT1、GST-CT2和GST-CT3，其中GST-CT1包含了 EF-hand，preIQ和IQ序列（圖1）。結(jié)果表明：成功純化得到 GST-CT1、GST-CT2和 GST-CT3；在 2 mmol/L［Ca2+］，CaM幾乎不與空白GS-4B或GST結(jié)合；純化的3個(gè)CaV1.2 C-末端的3個(gè)融合蛋白片段，只有GST-CT1可與CaM穩(wěn)定結(jié)合（圖2）；作為對(duì)照，CaM幾乎不與空白GS-4B或GST結(jié)合，表明CaM可特異性地與GST-CT1結(jié)合（圖2）。

圖2 純化后GST-CT1、GST-CT2、GST-CT3與CaM的相互結(jié)合作用Fig.2 SDS-PAGE of purified GST-CT1，GST-CT2，GST-CT3which interacted with CaM

2.2 CaM與GST-CT1結(jié)合的濃度依賴性

如圖3所示：在2 mmol/L［Ca2+］條件下，隨著反應(yīng)體系中的CaM濃度增加，結(jié)合到GST-CT1上的CaM量也逐漸增加，呈濃度依賴性，在此劑量范圍內(nèi)，其濃度—結(jié)合量的擬合曲線為“S”型。

圖3 CaM與GST-CT1結(jié)合的濃度依賴性Fig.3 Concentration-dependent binding of CaM to CT1

2.3 GST-CT1與CaM突變體結(jié)合的濃度依賴性

CaM與Ca2+形成Ca2+/CaM復(fù)合物之后才能與CaV1.2上的CaM結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮生理作用，突變后的CaM很難與之結(jié)合［9，14］。CaM的N-lobe和C-lobe在調(diào)節(jié)通道活性上具有不同的作用［3，15］。因此，本實(shí)驗(yàn)還研究了在2 mmol/L［Ca2+］條件下CaM 3種突變體與GST-CT1的結(jié)合。結(jié)果表明：CaM12、CaM34、CaM1234均可與GST-CT1結(jié)合，且隨著反應(yīng)體系中CaM突變體濃度的增加，結(jié)合到GST-CT1上的量也逐漸增加（圖4），濃度—結(jié)合量的擬合曲線為“S”型。在 2 mmol/L［Ca2+］條件下，CaM 3 種突變體可以與GST-CT1結(jié)合，并具有濃度依賴性，但是在同一濃度，它們結(jié)合到CT1的量明顯低于野生型CaM結(jié)合到CT1的量。

圖4 CaM突變體與GST-CT1結(jié)合的濃度依賴性Fig.4 Concentration-dependent binding of CaM mutants to CT1

3 討論

細(xì)胞內(nèi)鈣在生物信息傳遞和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。細(xì)胞外鈣內(nèi)流主要通過(guò)鈣通道，鈣通道主要包括電壓依賴性鈣通道（voltage-dependent calcium channel，VDCC）和受體操控鈣通道（receptor-operated channel，ROC）。VDCC 根據(jù)通道電導(dǎo)、對(duì)電壓敏感性及對(duì)不同阻斷劑反應(yīng)的不同，又進(jìn)一步分為L(zhǎng)、N、T、P、Q和R型，其中L型鈣通道是目前最具藥理學(xué)意義的一類鈣通道，其激活電位為-10～+10 mV，通道被激活后持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，失活慢。L-型鈣通道廣泛存在于各種細(xì)胞中，尤其是心肌和血管平滑肌細(xì)胞，功能上與興奮—收縮耦聯(lián)、興奮—分泌耦聯(lián)有密切關(guān)系。在蛋白家族分類上，根據(jù)鈣通道α1亞基氨基酸序列的不同，鈣通道分為CaV1-3的3個(gè)亞家族：其中CaV1.x中的CaV1.1，CaV1.2和CaV1.3均介導(dǎo)L-型鈣通道電流，CaV2.x中的CaV2.1、CaV2.2和CaV2.3分別介導(dǎo) P/Q型、N型和 R型，而CaV3.x介導(dǎo)T型鈣電流。

CaM是一種廣泛存在于生物體的鈣結(jié)合蛋白，它是細(xì)胞內(nèi)鈣的重要受體，參與動(dòng)植物細(xì)胞中多種酶和生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。CaM是調(diào)節(jié)L-型鈣通道活性過(guò)程中的鈣感受器［3，9］，且鈣通道C末端A、C或CB、IQ區(qū)域、N末端以及Ⅰ-Ⅱ環(huán)等區(qū)域均可以與CaM結(jié)合，從而調(diào)節(jié)CDF和CDI，其中α1c亞基C末端的IQ基序是最受公認(rèn)的CaM結(jié)合位點(diǎn)。

GST pull-down assay是研究蛋白之間相互作用的重要實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是將靶蛋白—GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上，作為與目的蛋白親和的支持物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過(guò)柱，誘餌蛋白可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白（目的蛋白）”，洗脫結(jié)合物后通過(guò)SDSPAGE電泳分析，從而證實(shí)2種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白?！罢T餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。

本研究采用GST pull-down assay實(shí)驗(yàn)方法，將CaV1.2的C末端分成CT1（包含EF-hand、CB、IQ基序）、CT2、CT3 3個(gè)片段作為“誘餌蛋白”，其中 CT2、CT3作為對(duì)照，分別研究其與“捕獲蛋白”CaM之間的相互作用。本研究結(jié)果證明在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白經(jīng)GS-4B純化后的CT1蛋白純度及濃度均較好；純化后CT1可穩(wěn)定與Ca2+/CaM結(jié)合，表明此方法純化后的蛋白具有生物學(xué)活性；CaM可特異性地與CT1結(jié)合，且結(jié)合呈濃度依賴性；CaM的3種突變體也可與GST-CT1結(jié)合，并具有濃度依賴性。綜上所述，本研究成功純化了CaV1.2蛋白片段并順利完成GST pull-down assay實(shí)驗(yàn)，為深入研究蛋白相互作用或發(fā)現(xiàn)新的蛋白相互作用奠定基礎(chǔ)。

［1］Berridge MJ.Elementary and global aspects of calcium signalling［J］.J Physiol，1997，499（Pt 2）：291-306.

［2］Peterson BZ，DeMaria CD，Adelman JP，et al.Calmodulin is the Ca2+sensor for Ca2+-dependent inactivation of L-type calcium channels［J］.Neuron，1999，22（3）：549-558.

［3］Dick IE，Tadross MR，Liang H，et al.A modular switch for spatial Ca2+selectivity in the calmodulin regulation of CaV channels［J］.Nature，2008，451（7180）：830-834.

［4］Asmara H，Minobe E，Saud ZA，et al.Interactions of calmodulin with the multiple binding sites of CaV1.2 Ca2+channels［J］.J Pharmacol Sci，2010，112（4）：397-404.

［5］Halling DB，Aracena-Parks P，Hamilton SL.Regulation of voltagegated Ca2+channels by calmodulin ［J］.Sci STKE，2005，315（er1）：1-10.

［6］Pitt GS.Calmodulin and CaMKII as molecular switches for cardiac ion channels［J］.Cardiovasc Res，2007，73（4）：641-647.

［7］Saud ZA，Minobe E，Wang WY，et al.Calpastatin binds to a calmodulin-binding site of cardiac CaV1.2 Ca2+channels［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，364（2）：372-377.

［8］Zhang M，Yuan T.Molecular mechanisms of calmodulin′s functional versatility［J］.Biochem Cell Biol，1998，76（2-3）：313-323.

［9］LeeA，Zhou H，Scheuer T，et al.Molecular determinants of Ca2+/calmodulin-dependent regulation of CaV2.1 channels［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（26）：16059-16064.

［10］Frangioni JV，Neel BG.Solubilization and purification of enzymatically active glutathione S-transferase （pGEX）fusion proteins［J］.Anal Biochem，1993，210（1）：179-187.

［11］Wang WY，Hao LY，Minobe E，et al.CaMKII phosphorylates a threonine residue in the C-terminal tail of CaV1.2 Ca2+channel and modulates the interaction of the channel with calmodulin ［J］.J Physiol Sci，2009，59（4）：283-290.

［12］Kim J，Ghosh S，Nunziato DA，et al.Identification of the components controlling inactivation of voltage-gated Ca2+channels［J］.Neuron，2004，41（5）：745-754.

［13］何桂林，郭風(fēng)，封瑞，等.重組鈣調(diào)蛋白及其突變體的分離純化及活性鑒定［J］.中國(guó)生化藥物，2012，33（6）：743-746.

［14］Zühlke RD，Pitt GS，Deisseroth K，et al.Calmodulin supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels［J］.Nature，1999，399（6732）：159-162.

［15］Guo F，Minobe E，Yazawa K，et al.Both N-and C-lobes of calmodulin are required for Ca2+-dependent regulations of CaV1.2 Ca2+channels［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（2）：1170-1176.