鄒吉麗，尹照萍，張利群，王永權(quán)，齊國先

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110001；2.寬甸縣中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 寬甸 118200；3.遼寧盤錦遼河油田婦嬰醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 盤錦 124010；4.沈陽醫(yī)學(xué)院人文教研室，沈陽 110034）

近年來炎癥學(xué)說備受重視，炎癥在冠心病的發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后中起重要的作用。過度的炎性反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一，如白細(xì)胞滲出、水腫、組織壞死及炎性細(xì)胞因子的釋放。主要表現(xiàn)為促炎因子釋放增加，其中白細(xì)胞介素6（interlukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）占主導(dǎo)位置［1］。而確定缺血再灌注損傷早期炎性細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化，觀察其變化規(guī)律及峰值出現(xiàn)時(shí)間對(duì)應(yīng)用炎性因子抑制劑有積極的指導(dǎo)作用，可進(jìn)一步有效控制炎癥、保護(hù)心肌。本研究應(yīng)用缺血再灌注模型，研究缺血再灌注早期占主導(dǎo)地位的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的表達(dá)情況，觀察其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及峰值出現(xiàn)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠98只，體質(zhì)量260～300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分籠飼養(yǎng)于恒溫（20±2）℃、恒濕（50%～60%）、無特殊病原體條件下，飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料均經(jīng)滅菌后供動(dòng)物自由取用。將大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注組：根據(jù)大鼠再灌注時(shí)間不同分為7個(gè)小組，缺血（45 min）再灌注15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h 組，每組 8 只大鼠；假手術(shù)組：開胸穿線不結(jié)扎，按照再灌注時(shí)間又分7個(gè)小組，每組6只大鼠。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

ELASA試劑盒（美國R＆amp;D公司）、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號(hào)：090828）、心電圖機(jī)（上海光電儀器有限公司）、動(dòng)物人工呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司）、石蠟切片機(jī)（德國LEICA公司）、高速冰凍離心機(jī)（德國Sigma公司）、光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、低溫冰箱（日本SANYO公司）、ELX-800型酶標(biāo)儀（美國Bio-tek公司）。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備

大鼠用10%水合氯醛0.04 L/kg腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，氣管切開插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量 0.002～0.003 L，吸呼比 1∶1.5，呼吸頻率75次/min。經(jīng)左前胸第3、4肋間開胸，打開心包，擠出大部分心臟，暴露心臟及左心耳，以5/0線在距冠狀動(dòng)脈前降支根部1～2 mm系1個(gè)袢，其間穿過1根塑料管，拉緊袢，觀察心電圖變化，ST抬高為結(jié)扎成功，結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗。45 min后拔出塑料管，使冠狀動(dòng)脈血流再通，再灌時(shí)局部組織充血。分別于再灌注 15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h，先從右心房取血0.002～0.003 L，注入清潔干燥玻璃試管內(nèi)，待血液凝固后立即放入離心機(jī)3 000 r/min（4℃），離心15 min，取上清液，即得血清標(biāo)本，-80℃保存待測(cè)。取前降支結(jié)扎線下2 mm至心尖部左心室缺血心肌組織100 mg，搗碎組織，按1 mg/L加入含蛋白酶抑制劑與細(xì)胞裂解液的混合物4°C過夜后，20 000 r/min離心20 min。取上清于-80℃保存待測(cè)。假手術(shù)組在心臟同樣部位穿線但不結(jié)扎LAD，于相同時(shí)間點(diǎn)相同方法采集標(biāo)本。

1.4 血清及心肌組織中IL-6、TNF-α含量檢測(cè)

1.4.1 血清IL-6、TNF-α水平測(cè)定：將試劑盒平衡至室溫，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。溫育、洗滌、顯色、終止，以空白孔調(diào)零450 nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度（optical density，OD），計(jì)算IL-6、TNF-α的含量。

1.4.2 心肌組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定：標(biāo)本均采用ELISA法檢測(cè)，操作過程同血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法檢測(cè)每個(gè)組織標(biāo)本的蛋白含量，得出數(shù)值后，將勻漿液中的細(xì)胞因子含量（/mL）換算成蛋白中的細(xì)胞因子含量（/mg）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6含量比較

如表1、表2所示，在假手術(shù)組中，大鼠心肌組織中各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6含量無明顯變化（P＆gt;0.05）。在缺血再灌注組，TNF-α和IL-6含量再灌注15 min時(shí)開始增高，2 h達(dá)高峰，4～6 h逐漸下降，24 h略有回升。與假手術(shù)組各對(duì)應(yīng)時(shí)間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆lt;0.01）。

表1 心肌組織中TNF-α含量比較（±s，pg/mg）Tab.1 Comparison of content of TNF-αin myocardial tissue（±s，pg/mg）

表1 心肌組織中TNF-α含量比較（±s，pg/mg）Tab.1 Comparison of content of TNF-αin myocardial tissue（±s，pg/mg）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

Group TNF-α 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 17.61±2.081） 21.75±2.761） 33.56±3.311） 40.23±3.231） 39.35±3.051） 20.55±2.661） 23.77±3.361）Sham 12.61±1.94 14.12±1.70 13.56±1.72 12.96±1.91 13.85±1.27 12.96±2.14 13.71±2.18

表2 心肌組織中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.2 Comparison of content of IL-6 in myocardial tissue（±s，pg/mg）

表2 心肌組織中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.2 Comparison of content of IL-6 in myocardial tissue（±s，pg/mg）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

Group IL-6 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 16.34±2.181） 21.23±3.661） 33.54±3.661） 39.24±3.621） 38.15±3.831） 18.93±3.051） 21.93±2.751）Sham 14.48±1.75 15.20±2.02 14.60±1.72 15.56±2.10 15.40±1.73 14.51±2.03 13.68±2.41

2.2 各組大鼠血清不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6含量比較

在假手術(shù)組中，TNF-α、IL-6各時(shí)間點(diǎn)比較無明顯變化（P＆gt;0.05）。在缺血再灌注組血清中TNF-α、IL-6再灌注15 min增高，之后持續(xù)升高，2 h達(dá)高峰，6 h有所下降，24 h略有升高。與假手術(shù)組相同時(shí)間點(diǎn)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆lt;0.01）。見表3、4。

表3 血清中TNF-α含量比較（±s，ng/mL）Tab.3 Comparison of content of TNF-αin serum（±s，ng/mL）

表3 血清中TNF-α含量比較（±s，ng/mL）Tab.3 Comparison of content of TNF-αin serum（±s，ng/mL）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

TNF-α 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 1.92±0.251） 2.46±0.391） 3.58±0.431） 3.93±0.451） 3.85±0.471） 2.25±0.271） 2.56±0.421）Sham 1.45±0.18 1.51±0.23 1.49±0.19 1.53±0.27 1.56±0.23 1.49±0.21 1.38±0.21 Group

表4 血清中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.4 Comparison of content of IL-6 in serum（±s，pg/mg）

表4 血清中IL-6含量比較（±s，pg/mg）Tab.4 Comparison of content of IL-6 in serum（±s，pg/mg）

1）P＆lt;0.01 vs sham group.

IL-6 15 min 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h I/R 198.3±28.321） 255.2±28.191） 367.8±30.221） 402.1±29.081） 400.3±22.201） 225.3±18.361） 257.8±21.461）Sham 144.9±18.15 151.7±15.24 145.6±21.66 155.3±18.74 154.7±15.98 146.1±17.84 139.4±17.60 Group

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是指原缺血心肌恢復(fù)血供后發(fā)生更為嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為再灌注心律失常、無復(fù)流、心肌頓抑、微循環(huán)障礙、猝死等。心肌缺血再灌注存在較復(fù)雜的機(jī)制，在這過程中，心肌中TNF-α含量明顯增加。TNF-α是分子量為17 kDa的可溶性多肽，以二聚體、三聚體或五聚體的形式存在于溶液中，它在機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)由激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的殺傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及體內(nèi)的免疫代謝等作用，也參與炎性反應(yīng)、介導(dǎo)休克、組織損傷等病理生理反應(yīng)［1，2］。TNF-α 可激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)氧自由基產(chǎn)生、活化中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等，加重心肌缺血再灌注損傷。TNF-α產(chǎn)生的具體機(jī)制主要包括［3］：（1）過氧化氫誘導(dǎo)的 p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號(hào)通路，近年來發(fā)現(xiàn)該通路為一類新的MAPK通路，不但在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，而且參與細(xì)胞的存活、分化和凋亡等過程。再灌注過程可激活p38 MAPK，使細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，其中包括TNF-α。（2）心肌缺血再灌注過程可激活核因子 κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB），NF-κB 在TNF-α產(chǎn)生的過程中起重要作用。激活NF-κB后，kB 抑制蛋白（inhibition-kappa B，I-κB）磷酸化，導(dǎo)致NF-κB-I-κB 復(fù)合物分裂和 I-κB 的降解。NF-κB 一旦從I-κB中裂解出來，就從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并與4個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)中的1個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合而定位于 DNA。I-κB 被 MAPKs磷酸化并激活 NF-κB，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，激活TNF-α基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。在此過程中，TNF-α通過與靶細(xì)胞膜上TNF受體結(jié)合，活化的TNF-α受體通過一系列的反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)蛋白，如 Caspases、p38 MAPK 等，導(dǎo)致 Apo-1、NF-κB活化，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、存活和死亡［3］。因此阻斷TNF-α的產(chǎn)生，抑制其活化就可減輕缺血再灌注損傷的發(fā)生。

IL-6由多種細(xì)胞產(chǎn)生，主要由活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，也可由內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，活化的單核細(xì)胞是血液中IL-6的主要來源，局部組織的IL-6主要由成纖維細(xì)胞或局部巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-6是分子量19～28 kDa的糖蛋白，人IL-6前體為212肽，包括一段28肽的信號(hào)肽，成熟的IL-6含184個(gè)氨基酸殘基，轉(zhuǎn)錄后修飾時(shí)有N糖基化、O糖基化和磷酸化。對(duì)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血和神經(jīng)系統(tǒng)有多方面的作用。在病理狀態(tài)下，細(xì)胞因子IL-6會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)，表現(xiàn)為IL-6及其受體的缺陷、IL-6表達(dá)過高以及可溶性細(xì)胞因子受體的水平增加等［4］。研究表明，心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6主要由缺血及再灌注誘導(dǎo)［5］。IL-6處于炎癥調(diào)控的樞紐位置，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)流入缺血心肌組織，刺激中性粒細(xì)胞、心肌細(xì)胞表面分別表達(dá)CDllb/CDl8及細(xì)胞間黏附分子1，介導(dǎo)與心肌細(xì)胞結(jié)合，損傷心肌。目前已知，炎性細(xì)胞因子一方面能夠引起心肌收縮力下降，同時(shí)也能促使心肌細(xì)胞肥大、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)胚胎型蛋白、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及心肌細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生改變，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌梗死后激活免疫系統(tǒng)而發(fā)生的自身免疫反應(yīng)也是導(dǎo)致心肌細(xì)胞喪失的原因之一［6］。心肌梗死后，細(xì)胞因子明顯表達(dá)，在急性冠脈綜合征早期干預(yù)治療的過程中［7］，特別是在缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制中，炎性細(xì)胞因子起著明顯的反面作用。研究表明［7］，細(xì)胞因子參與冠狀動(dòng)脈硬化形成過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)心肌梗死后因免疫系統(tǒng)激活而發(fā)生的自身免疫反應(yīng)也是導(dǎo)致心肌細(xì)胞喪失的原因之一［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷早期細(xì)胞因子IL-6、TNF-α明顯表達(dá)，并呈動(dòng)態(tài)變化，再灌注15 min，TNF-α、IL-6 已增高，2～4 h 達(dá)峰值，4 h 后逐漸下降，可以觀察到，血清與心肌組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)濃度、動(dòng)態(tài)變化基本相同。但通過觀察外周血炎性細(xì)胞因子的變化和濃度是否可以來判斷組織的損傷時(shí)間及程度還需要我們進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，本研究探討了缺血再灌注損傷早期炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及規(guī)律，為早期應(yīng)用炎性細(xì)胞因子抑制劑、進(jìn)一步保護(hù)心肌提供理論依據(jù)，但其具體機(jī)制及更有效的藥物及給藥方法還需要我們進(jìn)一步的研究和探討。

［1］劉保江.丙泊酚對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷時(shí)NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)的影響［D］.山西醫(yī)科大學(xué)，2007.

［2］Morgan MJ，Kim YS，Liu ZG.TNF-alpha and reactive oxygen species in necrotic cell death［J］.Cell Res，2008，18（3）：343-349.

［3］Bartee E，Mohamed MR，McFadden G.Tumor necrosis factor and interferon：cytokines in harmony［J］.Curr Opin Microbiol，2008，11（4）：378-383.

［4］Dhingra S，Sharma AK，Slngla DK，et al.P38 and ERKI/2MAPKs mediate the interplay of TNF-alpha and IL-10 in regulating oxidative stress and cardiac myoyte apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（6）：H3524-3531.

［5］齊曉云，徐萍，李春華，等.血漿組織因子及其途徑抑制物對(duì)急性心肌梗死患者雷帕霉素支架置入后血栓形成的影響［J］中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（7）：639-641.

［6］谷高玲，趙國安，孫海燕，等.冠心病患者細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 1基因多態(tài)性的臨床意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（5）：436-438.

［7］Chao W.Toll-like receptor signaling：a critical modulator of cell survivalandischemicinjuryintheheart［J］.AmJPhysiolHeartCircPhysiol，2009，296（1）：H1-12.