吳 瑨，陸曉明，段雅樂

（1．華東師范大學(xué) 腦功能基因組學(xué)教育部重點實驗室、上海市腦功能基因組學(xué)重點實驗室，上海 200062，2．華東師范大學(xué) 圖書館，上海 200241）

0 引 言

在現(xiàn)代藥物研究中，天然產(chǎn)物的開發(fā)和利用占據(jù)著重要位置．海洋環(huán)境具有高鹽、高壓、低溫等特點，海洋生物為了適應(yīng)這樣獨(dú)特的生存環(huán)境，漸漸進(jìn)化出了與之相適應(yīng)的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)［1］．在海洋生物及其代謝產(chǎn)物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多新穎的生物活性物質(zhì)，如抗腫瘤藥物、生物毒素、酶抑制劑、抗病毒化合物以及抗菌素等［2］；因此，海洋資源的開發(fā)逐漸成為天然產(chǎn)物開發(fā)和利用的熱點．在海洋生物資源中，海洋真菌具有種類繁多、分布廣泛、次級代謝產(chǎn)物量大、生物活性物質(zhì)種類豐富等特點，因此從海洋真菌次級代謝產(chǎn)物中篩選生物活性物質(zhì)，逐漸成為海洋藥物資源開發(fā)的重要內(nèi)容［3］．

GPR41是GPR40脂肪酸受體家族的一員，其表達(dá)分布較為廣泛，在人、小鼠及大鼠等物種間的氨基酸序列高度保守．2003年Brown等人發(fā)現(xiàn)GPR41的配體是短鏈脂肪酸，即碳原子數(shù)小于6個的有機(jī)脂肪酸，如乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽［4］．GPR41為抑制型G蛋白（Gi）偶聯(lián)受體，G蛋白活化后對腺苷酸環(huán)化酶（AC）起抑制作用，引起環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平降低．目前，關(guān)于GPR41受體激動劑的篩選以及功能研究目前還所知甚少，已有研究表明GPR41受體參與包括食欲調(diào)節(jié)、能量代謝以及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)現(xiàn)象，該受體在生理和病理情況中可能扮演著重要角色．G蛋白偶聯(lián)受體是重要的潛在藥物靶點，篩選GPR41受體激動劑或拮抗劑既是藥物開發(fā)的重點，又將有助于推動該受體功能的研究．因此，本實驗利用本課題組已構(gòu)建的GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株，從海洋真菌次級代謝產(chǎn)物中篩選GPR41的激動劑．實驗結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，從福建莆田平海灣海藻來源的黃曲霉c－f－3（Aspergillusflavus）中提取到的環(huán)二肽類化合物環(huán)（L－脯－L－苯丙）二肽（17號）在G41－CHO、G12－CHO、Mock－CHO、SH－sy5y和HEK293等細(xì)胞中均能引起cAMP水平升高．腺苷酸環(huán)化酶的激活劑forskolin（Fsk）與17號化合物共處理組cAMP水平比Fsk單獨(dú)處理組進(jìn)一步升高．因此，17號化合物是通過抑制cAMP降解從而升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平．17號化合物可能是磷酸二酯酶（PDEs）潛在的抑制劑，本實驗結(jié)果為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 材料

DMEM培養(yǎng)基、RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和G418購自Gibco公司；384孔板購自Corning公司；cAMP檢測試劑盒購自法國CIS－Bio公司；用于cAMP測試的單體化合物為中國海洋大學(xué)分離提純并提供［5］；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑．

1．2 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Life sciences公司；Analyst HTTM儀購于Molecular Devices公司．

1．3 方法

1．3．1 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH－sy5y）和人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）購自中科院上海生物研究所細(xì)胞庫．上述兩種細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)．

GPR41－CHO和GPR12－CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和Mock－CHO細(xì)胞由本實驗室構(gòu)建并保存．細(xì)胞株建立方法簡要說明如下：利用人基因組DNA克隆全長GPR41或GPR12基因并插入真核表達(dá)載體pcDNA3．1－N－myc中．構(gòu)建GPR41或GPR12真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后篩選單克隆細(xì)胞株．通過定量PCR、Western Blot及cAMP等方法檢測GPR41或者GPR12受體的表達(dá)和活性．pcDNA3．1－N－myc空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞經(jīng)單克隆篩選、鑒定后命名為Mock－CHO細(xì)胞．上述細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素和750μg／mL G418的RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)．

1．3．2 用于篩選的化合物作用濃度

本實驗利用GPR41受體的內(nèi)源性配體丁酸鈉（butyrate，NaB）作為陽性對照［4］，工作濃度為500μmol／L．

單體化合物在篩選過程中分為初篩和復(fù)篩，初篩濃度為10μmol／L，1μmol／L和100 nmol／L，每個濃度做1個平行孔．根據(jù)初篩結(jié)果，選取最適濃度進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩做3個平行孔，每組實驗重復(fù)3次．

1．3．3 cAMP檢測法標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

將CIS cAMP檢測試劑盒中的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為2 848（nmol·L－1），將cAMP標(biāo)準(zhǔn)品與Buffer Mix按1∶3的比例倍比稀釋，稀釋方法如下：

標(biāo)準(zhǔn)品 制備方法 工作液濃度／（nmol·L－1） 終濃度／（nmol·L－1）標(biāo)準(zhǔn)品7 80μL cAMP標(biāo)準(zhǔn)液2 848 712標(biāo)準(zhǔn)品6 20μL標(biāo)準(zhǔn)品7＋60μL Buffer mix 712 178標(biāo)準(zhǔn)品5 20μL標(biāo)準(zhǔn)品6＋60μL Buffer mix 178 44．5標(biāo)準(zhǔn)品4 20μL標(biāo)準(zhǔn)品5＋60μL Buffer mix 44．5 11．1標(biāo)準(zhǔn)品3 20μL標(biāo)準(zhǔn)品4＋60μL Buffer mix 11．1 2．78標(biāo)準(zhǔn)品2 20μL標(biāo)準(zhǔn)品3＋60μL Buffer mix 2．78 0．69標(biāo)準(zhǔn)品1 20μL標(biāo)準(zhǔn)品2＋60μL Buffer mix 0．69 0．17標(biāo)準(zhǔn)品0 60μ L Buffer mix 0 0

cAMP反應(yīng)每個樣品均設(shè)復(fù)孔．在黑色384孔板中加入5μL標(biāo)準(zhǔn)品和5μL compound buffer，混勻后加入10μL anti－cAMP Cryptate，室溫避光反應(yīng)1h．測665nm和620nm下的熒光值．以cAMP各標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以665nm／620nm的熒光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1．3．4 cAMP檢測法篩選海洋真菌次生代謝產(chǎn)物

將GPR41－CHO，GPR12－CHO，Mock－CHO，SH－sy5y和HEK293細(xì)胞分別以每孔103個細(xì)胞的密度鋪384孔板（孔底和孔壁均為黑色），鋪板24h后進(jìn)行cAMP檢測．前人研究已證實GPR41屬于Gi偶聯(lián)受體，因此需先用AC酶激活劑forskolin誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，當(dāng)GPR41受體與其配體結(jié)合后，導(dǎo)致cAMP濃度降低，以此來測定GPR41的活化情況．而GPR12屬于激動型G蛋白（Gs）偶聯(lián)受體，GPR12受體被配體激活后引起cAMP水平升高．因此，本實驗將測試的單體化合物分為兩組，一組將被測化合物直接加入細(xì)胞，孵育30min后測cAMP濃度；另一組用10μmol／L Fsk預(yù)處理細(xì)胞30min后，再加入被測化合物作用30min后進(jìn)行cAMP檢測．cAMP檢測方法按照法國CIS－Bio公司cAMP檢測試劑盒的說明書操作［6］，其實驗原理為細(xì)胞內(nèi)源cAMP與XL665標(biāo)記的cAMP競爭結(jié)合cAMP抗體，根據(jù)樣品665 nm／620nm的熒光值，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計算并分析細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的變化情況．

1．3．4 數(shù)據(jù)處理及分析

本實驗所有數(shù)據(jù)及作圖均用Sigma－Plot 9．0軟件處理，每組實驗設(shè)3個平行孔并重復(fù)3次．實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示．

2 實驗結(jié)果

2．1 GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株受體活性驗證

本實驗利用GPR41受體的內(nèi)源性配體丁酸鈉（butyrate，NaB）作為陽性對照，用于驗證GPR41－CHO穩(wěn)定細(xì)胞株具有GPR41受體激動活性．實驗結(jié)果如圖1所示，10μmol／L Fsk在GPR41－CHO和Mock－CHO細(xì)胞中均能引起cAMP水平升高（約2～3倍），加入500μmol／L丁酸鈉作用30min后，GPR41－CHO細(xì)胞內(nèi)cAMP水平顯著下降（P＜0．05），而Mock－CHO細(xì)胞中cAMP水平未見明顯變化（P＞0．05）．該實驗結(jié)果驗證了GPR41－CHO細(xì)胞具有GPR41受體激動活性，也說明本實驗運(yùn)用的cAMP檢測方法準(zhǔn)確可靠，可用于進(jìn)行后續(xù)受體激動劑篩選．

圖1 500μmol／L丁酸鈉和10μmol／L forskolin作用于G41－CHO和Mock細(xì)胞引起的cAMP水平變化Fig．1 Effect of butyrate（500μmol／L）and Fsk（10μmol／L）on cAMP accumulation in GPR41－CHO and mock cells

2．2 GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株17號化合物cAMP篩選結(jié)果

將17號化合物（1μmol／L和10μmol／L）直接作用于GPR41－CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)17號化合物可以引起G41－CHO細(xì)胞內(nèi)cAMP水平顯著升高（P＜0．05）．用10μmol／L Fsk預(yù)處理細(xì)胞30min后，再加入17號化合物可引起cAMP水平進(jìn)一步升高，且fsk與17號化合物共處理組cAMP水平增加比fsk單獨(dú)處理組具有顯著差異（P＜0．01），具有劑量效應(yīng)．有趣的是在Mock－CHO細(xì)胞中得到了類似結(jié)果．17號化合物在GPR41過表達(dá)細(xì)胞和mock細(xì)胞中均能引起cAMP增加，該實驗結(jié)果說明，17號化合物引起cAMP水平升高不依賴于GPR41受體．其余化合物未見類似作用．

圖2 17號化合物（10μmol／L，1μmol／L）和10μmol／L Fsk作用于G41－CHO和Mock－CHO細(xì)胞引起cAMP水平顯著增高Fig．2 No．17compound（10μmol／L，1μmol／L）and 10μmol／L Fsk induced a marked increase in intracellular cAMP production in G41－CHO and Mock cells

2．3 GPR12穩(wěn)定細(xì)胞株17號化合物cAMP篩選結(jié)果

17號化合物引起GPR41－CHO和Mock－CHO細(xì)胞cAMP水平升高，該實驗結(jié)果說明17號化合物引起cAMP水平變化不依賴于GPR41受體．因此本實驗室成功構(gòu)建的另一種GPCR穩(wěn)定細(xì)胞株（GPR12－CHO）被用于進(jìn)行cAMP篩選．GPR12為Gs偶聯(lián)型G蛋白偶聯(lián)受體，該受體激活后可引起cAMP水平升高［7］．實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1μmol／L和10μmol／L 17號化合物作用于GPR12－CHO細(xì)胞和Fsk預(yù)處理過的GPR12－CHO均可引起cAMP水平升高，該實驗結(jié)果與G41－CHO和mock細(xì)胞得到的結(jié)果類似，說明17號化合物引起cAMP水平升高不依賴于激活G蛋白偶聯(lián)受體．

圖3 17號化合物（10μmol／L，1μmol／L）和10μmol／L Fsk作用于G12－CHO細(xì)胞引起cAMP水平顯著增高Fig．3 Intracellular cAMP formation was increased significantly in G12－CHO cells with addition of No．17compound（10μmol／L，1μmol／L）and 10μmol／L Fsk

2．4 SH－sy5y細(xì)胞和HEK293細(xì)胞進(jìn)行17號化合物cAMP篩選結(jié)果

17號化合物在Gs、Gi偶聯(lián)受體穩(wěn)定細(xì)胞株和mock細(xì)胞內(nèi)均可引起cAMP升高，該結(jié)果說明17號化合物并非通過GPCR活化影響cAMP水平．因此野生型人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－sy5y和人類胚胎腎細(xì)胞HEK293被用于進(jìn)行后續(xù)17號化合物cAMP檢測．實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)17號化合物依然能夠在SH－sy5y和HEK293細(xì)胞中引起cAMP升高．多種細(xì)胞的cAMP檢測結(jié)果說明，17號化合物可能是通過抑制磷酸二酯酶（phosphodiesteras，PDEs）的活性，抑制cAMP的水解，從而增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度．

圖4 17號化合物（10μmol／L，1μmol／L）和10μmol／L Fsk作用于SH－sy5y和HEK293細(xì)胞引起cAMP水平顯著增高Fig．4 No．17compound（10μmol／L，1μmol／L）can promote the increase of intracellular cAMP in HEK293and SH－sy5y cells in presence or absence of Fsk

2．5 17號化合物結(jié)構(gòu)分析

17號化合物屬于環(huán)二肽類化合物．該類化合物在人、脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌和細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)．由于環(huán)二肽形成一個穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有一定的構(gòu)象約束作用．有兩個氫鍵給體和兩個氫鍵受體，氫鍵是藥物與受體相互作用的主要方式之一，因而環(huán)二肽在藥物化學(xué)中是一個重要的藥效團(tuán)．目前發(fā)現(xiàn)許多環(huán)二肽具有強(qiáng)的生理活性，如廣譜抗菌性能抑制HT－29，HeLa和MCF－7cell lines等癌細(xì)胞的生長、引起HT－29cells細(xì)胞凋亡等［8］，但目前尚未見該化合物與磷酸二酯酶抑制劑有關(guān)的報道．將已知的PDE抑制劑如Zaprinast和IBMX的化學(xué)結(jié)構(gòu)式與17號化合物進(jìn)行對比．如圖5所示，PDE抑制劑富含N和O，而且位置相對集中，具有疏水鉗的結(jié)構(gòu)特征，17號化合物具有相似的特征．因此，我們推測17號化合物通過抑制PDE活性，抑制cAMP降解從而引起cAMP水平升高．

3 討 論

近年來，從海洋生物資源中已經(jīng)分離得到了許多結(jié)構(gòu)新穎的海洋生物活性物質(zhì)［1］．其中海洋真菌因具有種類多、分布廣泛、次級代謝產(chǎn)物量大等特點，逐漸成為現(xiàn)代藥物研究的重點，也逐漸成為發(fā)現(xiàn)具有特異活性天然產(chǎn)物的重要途徑．

本實驗利用GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株，從福建莆田平海灣海藻來源的黃曲霉c－f－3中提取到的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了受體結(jié)合活性的cAMP測定．通過比較GPR41穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和Mock細(xì)胞株cAMP響應(yīng)的差異，篩選GPR41受體激動劑．前人研究已證實GPR41是Gi偶聯(lián)受體，若GPR41被激活應(yīng)導(dǎo)致cAMP水平降低［4］．而本實驗結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)環(huán)二肽類化合物（17號）在GPR41－CHO細(xì)胞和Mock－CHO細(xì)胞中均可引起cAMP水平升高．上述實驗說明17號化合物并非作用于GPR41引起cAMP升高．此后利用相同的處理方法在Gs偶聯(lián)型受體GPR12穩(wěn)定細(xì)胞株中檢測cAMP水平，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)17號化合物依然可以引起GPR12－CHO細(xì)胞cAMP水平升高．并且在野生型的SH－sy5y和HEK293細(xì)胞進(jìn)行cAMP檢測均得出了相似的結(jié)果．上述實驗結(jié)果說明17號化合物并非通過激活GPCR引起cAMP水平升高．而且fsk與17號化合物共處理組比fsk單獨(dú)處理組cAMP進(jìn)一步增加，fsk是AC有效的激活劑，上述實驗結(jié)果提示，17號化合物可能是通過抑制cAMP水解從而引起cAMP水平的持續(xù)升高．

圖5 PDE抑制劑Zaprinast和IBMX與17號化合物結(jié)構(gòu)對比Fig．5 Comparison of chemical structures between known PDE inhibitors（like Zaprinast and IBMX）and No．17compound

隨后，本文分析了17號化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該化合物屬于環(huán)二肽類化合物．該類化合物在自然界中的植物、動物特別是海洋微生物中廣泛存在［9］．其結(jié)構(gòu)骨架具有穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，且有兩個氫鍵給體和兩個氫鍵受體，因此這類化合物有機(jī)會成為重要的藥效團(tuán)．將已知的PDE抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式與17號化合物進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，17號化合物與已知的PDE抑制劑具有相似的特征，如富含N和O，且位置相對集中，具有疏水鉗的結(jié)構(gòu)特征等．因此，推測17號化合物通過抑制PDE活性，抑制cAMP降解從而引起cAMP水平升高．這是首次報道環(huán)（L－脯－L－苯丙）二肽（17號化合物）可在多種細(xì)胞中（G41－CHO，G12－CHO，Mock－CHO，SH－sy5y和HEK293）引起cAMP升高，但這種化合物是否是特異性磷酸二酯酶抑制劑，仍需要進(jìn)一步實驗證明．

綜上所述，海洋真菌次級代謝產(chǎn)物中具有豐富的環(huán)二肽類化合物，其中環(huán)（L－脯－L－苯丙）二肽可能成為潛在的磷酸二酯酶抑制劑．盡管目前對海洋活性物質(zhì)的開發(fā)起步較晚，仍有許多重要問題需要深入研究探討，但是以海洋生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)化合物從中篩選親和力高、毒性低的先導(dǎo)化合物，根據(jù)構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)特異性強(qiáng)、活性高、副作用小的天然小分子化合物將對新藥的開發(fā)產(chǎn)生重要影響．

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