鄧小耿， 邱榮林， 伍耀豪， 李治熹， 曾樂祥， 張 杰， 周嘉嘉， 唐 晶， 鄧潔敏

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院小兒外科，廣東廣州510120)

由于具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)為多種難治性肝病、代謝性肝病的細(xì)胞替代治療提供了源源不斷的種子細(xì)胞來源，但是其誘導(dǎo)分化的低效率及致瘤風(fēng)險(xiǎn)一直是難以解決的關(guān)鍵問題［1-2］。微小RNA(microRNA，miRNA)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)機(jī)制，在調(diào)控干細(xì)胞自我更新與分化、腫瘤發(fā)生等方面起著重要作用。miR-122是第一個(gè)被鑒定的肝特異性miRNA分子，它在肝臟胚胎發(fā)育、肝性維持、腫瘤發(fā)生、膽固醇與脂肪酸等多種物質(zhì)代謝過程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［3-4］。然而，如果將miR-122慢病毒載體直接轉(zhuǎn)染未分化的人胚胎干細(xì)胞并不能如預(yù)期地引起ESCs向內(nèi)胚層及肝細(xì)胞的定向分化［5］。本研究則力求證明miR-122能否促進(jìn)ESCs來源的肝前體細(xì)胞(hepatic precursor cells，HPCs)的分化與成熟。

材料和方法

1 材料

129小鼠 ESCs及ICR小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)均購于 Cyagen。HEK293A細(xì)胞及大腸桿菌Stb13均由廣州賽業(yè)公司提供。小鼠成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基、129小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基及擬胚體形成培養(yǎng)基均購于Cyagen。胎牛血清購于 HyClone。白蛋白(albumin，ALB)及細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗體均購于Abcam。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)抗體購于Santa Cruz。成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF-4)及丁酸鈉(sodium butyrate)分別購于Chemicon及Sigma。吲哚氰綠(indocyanine green，ICG)亦為Sigma產(chǎn)品?？剐∈驛LB抗體及抗小鼠CK18抗體均購于Abcam;抗小鼠AFP抗體購于Santa Cruz;Cy3標(biāo)記羊抗鼠 IgG及羊抗兔IgG購于Jackson。DAPI購于中國碧云天公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及胚體的制備

小鼠ESCs復(fù)蘇前1 d先復(fù)蘇經(jīng)γ射線滅活處理的ICR小鼠MEFs至6孔板中，接種密度為1．5×105/cm2。復(fù)蘇后第2天按照1∶6比例進(jìn)行傳代。選擇生長在MEF上狀態(tài)較好的ESCs克隆消化，充分消化，離心后用擬胚體形成液進(jìn)行重懸，重懸后首先將細(xì)胞接種在直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中(預(yù)先包被0．1%明膠)貼壁培養(yǎng)以去除MEFs，40 min后取出培養(yǎng)皿，輕輕用吸管吸出未貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5．5×107/L，然后接種于60 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿接種5 mL細(xì)胞懸液，放置37℃、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后可見大小不均勻的球形懸浮狀胚體，此時(shí)大部分胚體較小，胚體透亮，折光性良好，采用離心法(800 r/min離心1 min)或靜置3～5 min去除上清換液，換液后接種于新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d。在接下來的3 d中胚體逐漸增大，個(gè)別胚體較大，顯微鏡下折光性低，低倍鏡下胚體中心呈棕黑色，但高倍鏡下大部分胚體仍比較透亮緊密。

3 貼壁培養(yǎng)及誘導(dǎo)

胚體懸浮培養(yǎng)3 d后，800 r/min離心1 min或靜置3～5 min去除上清，用擬胚體形成液將擬胚體重懸，將其接種于24孔板(預(yù)先包被0．1%明膠)，每孔擬胚體數(shù)量約10～20個(gè)(如6孔板則需約50個(gè))。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液，見圖1。

Figure 1．The procedure for differentiation of mouse embryonic stem cells(ESCs)into hepatocytes via embryoid bodies(EBs)，defined embryoid bodies(DEBs)and hepatic precursor cells(HPCs)is presented schematically．FGF-4:fibroblast growth factor 4;HGF:hepatocyte growth factor;OSM:oncostatin M:Dex:dexamethasone．圖1 細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件

4 小鼠miR-122重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)我們的前期研究，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的引物序列，利用PCR擴(kuò)增出基因序列 attB1-miR122與IRES/eGFP-attB2，之后采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出基因序列attB1-miR122/IRES/eGFP-attB2。再將attB1-miR122/IRES/eGFP-attB2與入門載體pDonr221通過BP反應(yīng)形成入門克隆并進(jìn)行PCR篩選，接著再將包含有目的基因的入門克隆和目的載體pAV．Des1d通過LR反應(yīng)構(gòu)建出表達(dá)克隆并進(jìn)行PCR篩選。最終對(duì)表達(dá)克隆進(jìn)行測序、包裝、擴(kuò)增和濃縮。

5 腺病毒轉(zhuǎn)染肝前體細(xì)胞

EB至肝前體細(xì)胞階段進(jìn)行到第3天，對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行Ad-GFP及Ad-mir122-GFP轉(zhuǎn)染。吸去舊誘導(dǎo)液，加入新誘導(dǎo)液，以MOI=1∶100，按量加入腺病毒，其中24孔板轉(zhuǎn)染體積為1 mL，6孔板轉(zhuǎn)染體積為2 mL(24孔板細(xì)胞量約為105，腺病毒添加量約為10μL，6孔板細(xì)胞量約為106，腺病毒添加量約為100μL)。作用24 h后，吸去病毒液，換新誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)方案定期取樣備檢。

6 形態(tài)學(xué)觀察

用倒置相差顯微鏡及電子顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察多細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染miR-122后胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中各階段的細(xì)胞形態(tài)變化。

7 Real-time RT-PCR

取小鼠成熟肝細(xì)胞、ESCs、肝前體細(xì)胞、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體)轉(zhuǎn)染后的第2、4、6天細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-122)轉(zhuǎn)染后的第2、4、6天細(xì)胞分別用Trizol試劑提取總RNA。取2μg總RNA按照試劑盒說明書方法進(jìn)行real-time RT-PCR。引物如下:GAPDH:5’-TCGTCCGGTAGACAAAATGG-3’，5’-GAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3’;ALB:5’-CAGGATTGCAGACAGATAGTC-3’，5’-GCTACGGCACAGTGCTTG-3’;葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-P):5’-CAGGACTGGTTCATCCTT-3’，5’-GTTGCTGTAGTAGTCGGT-3’;甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transthyretin，TTR):5’-CTCACCACAGATGAGAAG-3’，5’-GGCTGAGTCTCTCAATTC-3’;α1 抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT):5’-AATGGAAGAAGCCATTCGAT-3’，5’-AAGACTGTAGCTGCTGCAGC-3’;細(xì)胞角蛋白8(cytokeratin 8，CK8):5’-AGATGAACCGGAACATCAGC-3’，5’-CATCCTTAATGGCCAGCTCT-3’;膽固醇 7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1):5’-TCCAGCGACTTTCTGGAGTT-3’，5’-GATTGCCTTCCAAGCTGACT-3’;細(xì)胞色素 P450 3A4(cytochrome P450 3A4，CYP3A4):5’-GAGAAATCTGAG GCGGGAAG-3’，5’-CAAAGGGGTCTTGTGGATTG-3’;引物均由TaKaRa合成。在real-time定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)并實(shí)時(shí)收集熒光信號(hào)，PCR采用三步法熱循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)如下:95℃ 60 s，95℃15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

8 免疫熒光檢測

誘導(dǎo)分化后，進(jìn)行免疫熒光檢測。Ⅰ抗抗體稀釋度為1∶100(稀釋液為0．5%Triton，放置于冰上進(jìn)行)，140μL/well，放置37℃搖床中孵育1 h。Ⅱ抗抗體稀釋度為1∶200(稀釋液為0．5%Triton，放置于冰上避光進(jìn)行)。分別加到相應(yīng)的孔中，140μL/well，操作均需避光進(jìn)行。37℃、80 r/min搖床孵育1 h(放于保濕盒內(nèi))。最后加入Hoechst 33342染液(0．5 mg/L);140 μL/well，室溫避光孵育 30 min。PBS洗滌后熒光觀察各抗體表達(dá)情況。

9 肝細(xì)胞功能學(xué)檢測

9．1 糖原染色 將擬胚體接種至24孔板中，分別對(duì)轉(zhuǎn)染空載體及轉(zhuǎn)染miR-122第6天的細(xì)胞進(jìn)行過碘酸－雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色。吸去誘導(dǎo)液，加入1 mL PBS洗1～2次，加入500μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，水洗，晾干。每孔滴加約200μL 1%過碘酸水溶液，氧化10 min，PBS洗2次。每孔加入500μL Schiff糖原染色溶液，置37℃孵箱5 ～10 min，取出后流水沖洗10～20 min，普通顯微鏡下觀察。胞漿內(nèi)呈紅色顆粒為陽性。

9．2 ICG攝取實(shí)驗(yàn) 將擬胚體接種至24孔板中，分別對(duì)轉(zhuǎn)染空載體及轉(zhuǎn)染miR-122第6天的細(xì)胞進(jìn)行ICG攝取率觀察。吸去誘導(dǎo)液，加入1 mL PBS洗1～2次，加入含100 mg/L ICG的肝成熟細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS清洗細(xì)胞3次后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取ICG情況，陽性細(xì)胞呈綠色。

9．3 尿素合成實(shí)驗(yàn) 按尿素氮檢測試劑盒(Sigma)說明書進(jìn)行比色法操作，步驟如下:設(shè)空白、對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)、樣品管。每管加0．5 mL尿素酶溶液。空白管加10μL水;標(biāo)準(zhǔn)管加10μL尿素氮標(biāo)準(zhǔn)溶液;對(duì)照管加10μL。對(duì)照培養(yǎng)液;樣品管加10μL樣品。混勻。37℃水浴5～10 min。各管逐步加入1 mL酚硝酸鹽溶液，1 mL堿性次氯酸鹽，5 mL純水，混勻。室溫20～30 min成色反應(yīng)。570 nm紫外分光光度計(jì)檢測吸光度。尿素氮濃度=樣品管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 形態(tài)學(xué)觀察

分別于誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染的不同時(shí)段采用倒置相差顯微鏡及電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察?！俺矤睢笨寺⌒陨L的小鼠ESCs(圖2A)經(jīng)體外懸浮培養(yǎng)2 d后可形成球狀懸浮的擬胚體。擬胚體中細(xì)胞排列緊密，無法看清單個(gè)的細(xì)胞，并有一半透明的外膜(圖2B)。隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行，EB的細(xì)胞逐漸由中心向周邊鋪散開來，誘導(dǎo)3 d后出現(xiàn)小上皮樣細(xì)胞，圓形為主，胚體中心仍呈片狀(圖3A);誘導(dǎo)6 d部分細(xì)胞呈三角形及不規(guī)則多邊形(圖3B);誘導(dǎo)9 d后，三角形及不規(guī)則多邊形細(xì)胞逐漸增多，說明通過誘導(dǎo)，細(xì)胞形態(tài)逐漸成熟，ESCs分化為 HPCs(圖3C)。轉(zhuǎn)染miR-122后6 d(圖4B)，細(xì)胞形態(tài)以多角形或規(guī)則多邊形為主，核大，胞漿豐富，核仁多見，形態(tài)趨于一致，且更接近成熟肝細(xì)胞(圖4C);而轉(zhuǎn)染空載體6 d后(圖4A)細(xì)胞雖然也有部分細(xì)胞呈規(guī)則多邊形，但其細(xì)胞形態(tài)均一性不佳，可見多數(shù)的片狀或塊狀幼稚細(xì)胞。由此可知，轉(zhuǎn)染miR-122可促進(jìn)小鼠肝前體細(xì)胞的分化與成熟。

Figure 2．The morphology of mouse ESCs and EBs(×50)．A:ESCs appeared“nested”clones after cultured in vitro for 2 d，and the edges appeared sharp and smooth．Cells packed tightly，and the boundary between cells was unclear．B:EBs were transparent with a good refractivity．Cells packed tightly，and there is a semitransparent membrane around EBs．圖2 小鼠胚胎干細(xì)胞及擬胚體形態(tài)

Figure 3．The mouse ESCs were induced into HPCs(×100)．A:3 d after induction，cells spread gradually from the center to the periphery of EBs;B:6 d after induction，most cells were round，though a little cells appeared triangle and irregular polygonal;C:9 d after induction，cells mostly appeared triangle and irregular polygonal，similar to HPCs in shape．圖3 小鼠胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)為肝前體細(xì)胞

Figure 4．miR-122 induced mouse HPCs into hepatocytes．A:6 d after transfection with empty vector，some cells appeared triangle and regular polygonal while there were still many naive cells(×200);B:6 d after transfection with miR-122，most cells were regular polygonal，with big nuclei，abundant cytoplasm，more nucleoli and unanimous shape(× 200);C:normal mouse hepatocytes were polygonal，with large and round nuclei in the center，and packed closely(× 200);D:6 d after transfection with miR-122，ultrastructural analysis revealed a system of organelles such as mitochondria，lysosomes，Golgi apparatus，rough and smooth endoplasmic reticulum(×8 000)．圖4 miR-122誘導(dǎo)小鼠肝前體細(xì)胞向肝細(xì)胞分化

2 肝特異性基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染 miR-122 后，細(xì)胞的 ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1及CYP3A4 mRNA的表達(dá)水平均逐漸升高，轉(zhuǎn)染后6 d可達(dá)成熟肝細(xì)胞80%以上。其中以ALB升高最為顯著，轉(zhuǎn)染后6 d，ALB mRNA的表達(dá)水平接近小鼠成熟肝細(xì)胞95%，見圖5。以上結(jié)果說明，轉(zhuǎn)染miR-122后，小鼠肝前體細(xì)胞可高表達(dá)肝特異性基因，并接近成熟肝細(xì)胞水平，這從mRNA水平上說明miR-122能夠促進(jìn)小鼠肝前體細(xì)胞的分化與成熟。

Figure 5．Detection of the mRNA expression levels of hepatocyte-specific genes by real-time RT-PCR．Mean±SD．n=3．*P＜0．05 vs control group at the same time point．圖5 Real-time RT-PCR檢測肝特異性基因的mRNA表達(dá)

3 免疫熒光染色檢測肝特異性蛋白的表達(dá)

采用FGF-4、丁酸鈉及Dex聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)9 d后，細(xì)胞形態(tài)以圓形為主，不規(guī)則多邊形細(xì)胞少，ALB及CK18含量不高，而AFP含量高(圖6A)。對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體，轉(zhuǎn)染3 d后細(xì)胞呈克隆樣增殖，形態(tài)同樣分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，見胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕紅色AFP、ALB與CK18蛋白，ALB及CK18表達(dá)量較單純誘導(dǎo)組稍有增高，AFP改變不大(圖6B)。實(shí)驗(yàn)組(miR-122轉(zhuǎn)染3 d后)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)規(guī)則多邊形，核大，胞漿豐富，形態(tài)更接近成熟肝細(xì)胞，ALB及CK18的含量相對(duì)單純誘導(dǎo)組和對(duì)照組而言均明顯升高，而AFP表達(dá)量卻降低(圖6C)，接近小鼠成熟肝細(xì)胞水平(圖6D)。以上結(jié)果說明miR-122在蛋白水平能促進(jìn)肝前體細(xì)胞的分化與成熟。

4 肝細(xì)胞功能學(xué)檢測

4．1 ICG攝取實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載體6 d的HPC，ICG攝取實(shí)驗(yàn)可見淡綠色的ICG陽性細(xì)胞(圖7A、B)，說明經(jīng) FGF-4、丁酸鈉及 Dex聯(lián)合誘導(dǎo)9 d的HPCs已經(jīng)具備部分肝細(xì)胞功能。而同期實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-122 6 d的HPCs中ICG陽性細(xì)胞數(shù)量則更多(圖7C、D)，說明轉(zhuǎn)染miR-122重組腺病毒表達(dá)載體后同時(shí)期的細(xì)胞具有相對(duì)更好的肝細(xì)胞功能。

4．2 糖原染色 轉(zhuǎn)染miR-122后6 d，糖原染色可見細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅染的糖原顆粒，表明其糖原合成和儲(chǔ)存功能明顯增強(qiáng)，見圖8。

4．3 尿素合成功能 ESCs基本沒有尿素合成功能，隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行，其尿素合成功能逐漸升高，轉(zhuǎn)染miR-122后升高明顯，于轉(zhuǎn)染后6 d接近成熟肝細(xì)胞80%的水平，見圖9。

Figure 6．Expression of hepatocyte-specific proteins in mouse ESCs after induction and transfection as well as normal mouse hepatocytes(immunofluorescence staining，×200)．A:ESCs 9 d after induction(HPCs group);B:HPCs 6 d after transfection with empty vector(control group);C:HPCs 6 d after transfection with miR-122(miR-122 group);D:normal and mature hepatocytes．圖6 小鼠ESCs經(jīng)誘導(dǎo)分化及轉(zhuǎn)染后其肝特異性蛋白的免疫熒光染色

Figure 7．ICG uptake test of transfected cells(×100)．A，B:control group，few cells took up ICG and showed dark green;C，D:miR-122 group，most cells took up ICG from the medium and showed dark green．B and D are modified pictures of A and C，respectively，in which the background color was deleted．圖7 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞吲哚氰綠攝取情況

討 論

近年來，對(duì)于ESCs的誘導(dǎo)分化研究進(jìn)展很快，已形成了多種方法和技術(shù)體系。從誘導(dǎo)因素的性質(zhì)來看，主要有以下幾類:(1)細(xì)胞因子與胞外基質(zhì)協(xié)同誘導(dǎo)。(2)添加表觀遺傳修飾物質(zhì)。如我們的前期研究結(jié)果表明丁酸鈉可以高效誘導(dǎo)小鼠ESCs分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并且分化細(xì)胞具有肝細(xì)胞功能［6］。(3)導(dǎo)入與肝臟發(fā)育相關(guān)的基因或啟動(dòng)子。Heo等［7］將白蛋白啟動(dòng)子導(dǎo)入小鼠 ESCs，使其表達(dá)綠色熒光蛋白，可有利于后續(xù)肝細(xì)胞樣細(xì)胞的分選、純化和移植。(4)共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)。如Ishii等［8］利用 CD45－CD49f+/－Thy1+gp38+間充質(zhì)細(xì)胞與小鼠胎肝細(xì)胞共同培養(yǎng)形成細(xì)胞間接觸，從而使其誘導(dǎo)為肝前體細(xì)胞。然而，以上誘導(dǎo)方法均不同程度的存在操作復(fù)雜以及誘導(dǎo)效率不高的問題胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化要經(jīng)歷從內(nèi)胚層、胚肝到成熟肝臟等多個(gè)時(shí)期，其中涉及復(fù)雜的基因調(diào)控過程。表觀遺傳修飾 (epigenetic modification)是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控基因沉默與激活的一個(gè)重要機(jī)制，它通過引起染色質(zhì)和核小體構(gòu)型改變來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，而不涉及基因本身序列的改變。干細(xì)胞的多能性與其胞內(nèi)廣泛的表觀遺傳特征密切相關(guān)，而運(yùn)用表觀遺傳修飾策略誘導(dǎo)干細(xì)胞分化已成為該領(lǐng)域一個(gè)新的研究方向［9］。Zhou等［10］的研究表明組蛋白去乙酞化酶抑制劑丁酸鈉可以在體外誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞分化為肝細(xì)胞。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)在肝細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中具有重要的生理作用，在肝臟發(fā)育到中期以后，周圍基質(zhì)細(xì)胞分泌的HGF進(jìn)一步促進(jìn)其生長分化，因HGF受體(c-Met)與FK506融合蛋白質(zhì)(FKBP-HGFR)可減少酪氨酸激酶和MAP激酶的活性，從而選擇性控制肝細(xì)胞的分化［11］，是肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究中常使用的細(xì)胞因子。Dex不但可上調(diào)在內(nèi)胚層發(fā)育成腹側(cè)前腸過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子GATA4、HNF3p和Hex，更重要的是它還可促HNF4a的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞的成熟［12］。我們的前期研究還表明用含淤膽血清的病理微環(huán)境培養(yǎng)體系能夠從經(jīng)FGF-4和HGF初步誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞中有效篩選出具有功能的肝細(xì)胞［13］。

Figure 8．Glycogen storage assayed by PAS staining(×100)．A:control group，little glycogen staining;B:miR-122 group，much more glycogen staining．圖8 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞糖原染色結(jié)果

Figure 9．Urea synthesis function detected in the five groups．Mean±SD．n=5．*P ＜0．05 vs control group．圖9 小鼠ESCs及其誘導(dǎo)分化各階段尿素合成功能檢測結(jié)果

所以本研究在誘導(dǎo)分化過程中使用了丁酸鈉、HGF和Dex聯(lián)合貫序誘導(dǎo)方法。通過對(duì)誘導(dǎo)分化中細(xì)胞形態(tài)的持續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)伴隨著細(xì)胞分化，胚胎干細(xì)胞逐漸獲得了上皮細(xì)胞樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)，于誘導(dǎo)分化第9天形成了以不規(guī)則多邊形及三角形形態(tài)為主的小鼠肝前體細(xì)胞。

MicroRNA是一種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，廣義上來講也是一種重要的表觀遺傳機(jī)制，通過作用于特定的mRNA序列而發(fā)揮基因沉默的調(diào)控作用，目前的研究表明其在ESCs分化過程中起著重要的作用。miR-9可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，miR-1和miR-133可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向中胚層方向分化［14-15］。但是，目前還沒有發(fā)現(xiàn)明確的能夠促進(jìn)ESCs向肝細(xì)胞分化miRNA。miR-122是第一個(gè)被鑒定的肝特異性miRNA，在小鼠胚胎植入12．5 d后的胎肝中即可被檢測，出生之前達(dá)到表達(dá)平臺(tái)期，在成熟肝細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞表達(dá)量達(dá)50 000拷貝以上［4］。我們的前期研究表明，在誘導(dǎo)ESCs向肝細(xì)胞分化的早期階段miR-122的表達(dá)水平極低，在第9天時(shí)才明顯上調(diào)，但與正常成熟肝細(xì)胞相比，其表達(dá)量也如肝癌細(xì)胞一樣，仍處于一個(gè)較低水平。然而，如果將miR-122慢病毒載體直接轉(zhuǎn)染未分化的人胚胎干細(xì)胞并不能如預(yù)期地引起ESCs向內(nèi)胚層及肝細(xì)胞的定向分化，相反地，其總體分化反而延遲［5］。結(jié)合體內(nèi)正常肝臟發(fā)育過程，我們首次提出了miR-122可能是在ESCs分化為肝細(xì)胞啟動(dòng)后即中晚期才發(fā)揮作用這一設(shè)想。為證實(shí)這一設(shè)想，我們選擇在小鼠ESCs誘導(dǎo)分化的第9天，即肝前體細(xì)胞階段才進(jìn)行miR-122的轉(zhuǎn)染，因?yàn)榇藭r(shí)miR-122的靶基因可能才開始表達(dá)。

我們前期采用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體pCDHCMV-miR122-EF1-copGFP轉(zhuǎn)染肝前體細(xì)胞，但其效果欠佳。其原因可能與質(zhì)粒的純度、細(xì)胞的適應(yīng)性等有關(guān)。之后我們通過摸索發(fā)現(xiàn)采用腺病毒空載體轉(zhuǎn)染同期細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較前明顯提高，故而我們重新構(gòu)建出了攜帶miR-122的重組腺病毒表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)第9天的肝前體細(xì)胞。對(duì)照組轉(zhuǎn)染不含miR-122的空載體。通過對(duì)比我們發(fā)現(xiàn):(1)在形態(tài)學(xué)方面，轉(zhuǎn)染miR-122后肝前體細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則多邊形，核大居中，部分細(xì)胞可見雙核，胞漿豐富。另外，其核仁也較對(duì)照組明顯增多。(2)在細(xì)胞表型方面，通過real-time RT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染miR-122后細(xì)胞肝特異性基因 ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1和CYP3A4的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，并且達(dá)到了正常肝細(xì)胞約80%的水平，其中ALB的表達(dá)水平甚至達(dá)到正常小鼠肝細(xì)胞95%水平;其次，通過免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)處理組的肝特異性蛋白ALB及CK18水平均升高，而AFP則降低。(3)最后，通過ICG攝取實(shí)驗(yàn)、糖原染色及尿素合成實(shí)驗(yàn)，我們均得出了實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞功能比對(duì)照組增強(qiáng)的結(jié)果，說明轉(zhuǎn)染miR-122后細(xì)胞在功能學(xué)上更接近成熟肝細(xì)胞水平。

我們的研究結(jié)果充分證明miR-122能夠有效地促進(jìn)肝前體細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化和成熟，同預(yù)期設(shè)想相一致。更重要的是，我們的誘導(dǎo)方法簡單、易于操作，并且誘導(dǎo)效率高。但是本研究還存在不足:如肝細(xì)胞的其它標(biāo)記物未能一一檢測，未檢測ALB的分泌量，沒對(duì)細(xì)胞色素P450功能進(jìn)行研究;另外，miR-122的具體的作用機(jī)制尚不明確，這些都是我們下一步將要進(jìn)行的研究。