管 凇，周漢林，侯冠彧，王東勁，徐鐵山

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

肌肉生成抑制素(Myostatin, MSTN)是一種能夠?qū)∪馍L起負(fù)調(diào)控作用的分泌蛋白[1]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因編碼的蛋白質(zhì)對(duì)骨骼肌有負(fù)調(diào)控作用，主要是控制和維持骨骼肌細(xì)胞的數(shù)量和體積[2]。研究還發(fā)現(xiàn)，如果動(dòng)物缺乏MSTN基因，便出現(xiàn)肌肉增大，骨骼肌肌群分布廣，且脂肪不增加等現(xiàn)象[3-4]。McPherron[3]等利用基因敲除技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，該基因敲除后鼠的體重是正常鼠體重的2～3倍，其肩、臀部的肌肉明顯肥大，肌纖維數(shù)目增加，骨骼肌肌群分布更廣泛[5]。目前世界著名的比利時(shí)蘭牛(Belgian blue)和皮埃蒙特牛(Piedmontese)，就是由于MSTN基因突變而出現(xiàn)的雙肌現(xiàn)象[6]，Lorenxen[7]在道賽特羊中也發(fā)現(xiàn)了雙肌現(xiàn)象，并且這種現(xiàn)象能遺傳給后代，其臀部肌肉比較發(fā)達(dá)，因而被稱做Callipyge。

MSTN作為肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，研究其結(jié)構(gòu)和功能，確定MSTN基因在各種動(dòng)物的具體表達(dá)部位概況及表達(dá)量信息，對(duì)于闡明骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)理具有十分重要的意義。在其表達(dá)豐度最高時(shí)，采取基因敲除術(shù)、抗體注射、轉(zhuǎn)基因、反義核酸等技術(shù)，降低MSTN基因的表達(dá)量，從而會(huì)使肌肉充分發(fā)育，以提高產(chǎn)肉量、瘦肉量及飼料轉(zhuǎn)化率[8]，在畜牧生產(chǎn)上有極好的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)對(duì)MSTN多見其在豬、牛、羊、雞上作為肉質(zhì)性狀候選基因的多態(tài)性研究[9-18]。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，探討MSTN基因在海南黑山羊腿肌、腰肌、背肌等組織中的表達(dá)差異及其發(fā)育變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究MSTN基因?qū)θ赓|(zhì)性狀的調(diào)控機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)羊場的海南黑山羊2、3、4月齡公羔和12月齡公羊各3只(相同營養(yǎng)水平，相同飼養(yǎng)環(huán)境)屠宰后取腿肌、腰肌和背肌，置液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

所用主要儀器包括核酸提取儀Maxwell 16(Promega公司)，熒光定量PCR儀(eppendorf)，PCR儀(德國B-iometra)，凝膠成像系統(tǒng)(法國VILBER)，紫外分光光度計(jì)；RNA提取試劑盒(Maxwell 16 Total RNA Purification Kit)購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM )購自大連寶生物。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 利用核酸提取儀提取總RNA，操作步驟按照Maxwell 16 Total RNA Purification Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，RNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，將每個(gè)樣品稀釋成一致濃度備用。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×prime ScriptTM Buffer (for Real Time)20 μL，終濃度1×，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1.0 μL，Oligo dT Primer (50 pM) 1.0 μL，終濃度20 pmol，Random 6 mers (100 μM) 1.0 μL，終濃度50 pmol，Total RNA 1.0 μL，Rnase Free ddH2O up to 15 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 放置-30 ℃ 冰箱保存待用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank已知序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，送上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物信息詳見表1。

表1 熒光定量RT-PCR所用引物的相關(guān)信息Table 1 Real time RT-PCR primer information

注：β-actin為內(nèi)參基因。

Notes：β-Actin used as housekeeping gene.

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 本試驗(yàn)采用SYBR Green I 染料法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，在realplex4型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25 μL：其中SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL, 引物(10 pmol/μL)1 μL, cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL，95 ℃預(yù)熱30 s，PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性5s，57 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s，42個(gè)循環(huán)；根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

在保證擴(kuò)增效率的前提下，參照Winer等方法[19]，用2-△△Ct法度量MSTN基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以β-Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一生長時(shí)期三種肌肉組織中MSTN基因表達(dá)差異

MSTN基因在同一生長時(shí)期三種肌肉組織之間的表達(dá)模式見圖1(A，B，C，D)，結(jié)果顯示，該基因在2，3，4和12月齡之內(nèi)的三種肌肉組織中的mRNA表達(dá)模式一致，即在背肌里的表達(dá)量最高，在腿肌里表達(dá)量最低，表達(dá)模式為：背肌>腰肌>腿肌，2月齡時(shí)，腰肌和背肌之間的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，腿肌的表達(dá)量極顯著低于腰肌和背肌(P<0.01)；3月齡時(shí)，腿肌和腰肌之間的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，背肌的表達(dá)量極顯著高于腿肌和腰肌(P<0.01)，4月齡時(shí)，三種組織間的表達(dá)量存在極顯著差異(P<0.01),12月齡時(shí)，腿肌和腰肌之間的。表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，在背肌里表達(dá)量極顯著大于腿肌和腰肌(P<0.01)。

2.2 不同生長時(shí)期三種肌肉組織中MSTN基因的mRAN表達(dá)變化

MSTN基因在海南黑山羊不同生長時(shí)期三種肌肉組織中的mRNA表達(dá)變化見圖2(A、B、C)，結(jié)果顯示，該基因在2、3、4和12月齡的腿肌和腰肌里的表達(dá)發(fā)育性變化模式一致，即在2、4月齡的表達(dá)量極顯著低于3、12月齡(P<0.01)，2、4月齡之間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，3、12月齡之間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，腿肌和腰肌的表達(dá)發(fā)育模式為12月齡>3月齡>4月齡>2月齡，而背肌的表達(dá)發(fā)育模式與腿肌和腰肌有所差異，背肌在三月齡的表達(dá)量極顯著高于其他月齡(P<0.01)，在2、3、4月齡之間的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，其表達(dá)模式為：3月零>12月零4月齡>2月齡。

整體而言，該基因在背肌里的表達(dá)量最高，腿肌里的表達(dá)量較低，三種肌肉組織均在2月零時(shí)，表達(dá)量較低，3月齡時(shí)極顯著升高(P<0.01)，4月齡時(shí)又極顯著下降(P<0.01)，12月齡時(shí)又極顯著升高(P<0.01)；背肌在前三個(gè)階段表達(dá)模式與腿肌和腰肌一致，而在4月齡又極顯著下降之后(P<0.01)，12月齡時(shí)雖有所上升，但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 MSTN基因在海南黑山羊同一生長時(shí)期3種肌肉組織中的表達(dá)差異Fig.1 The differences of MSTN mRNA in three muscle tissues at the same period of growth for Hainan Black Goat

注：不同的字母之間表示差異極顯著(P<0.01)，相同的字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: Values with different letters mean extreme difference (P<0.01),those with same letter mean insignificant difference (P>0.05).The same below.

圖2 MSTN基因在海南黑山羊不同生長時(shí)期三種肌肉組織中的表達(dá)變化規(guī)律Fig.2 The developmental changes of MSTN mRNA in three muscle tissues at different period of growth for Hainan Black Goat

3 討 論

MSTN的生理作用主要是與動(dòng)物產(chǎn)前胎兒期的肌肉增長有關(guān)[20]。但根據(jù)研究表明，在動(dòng)物出生前和出生后骨骼肌中均能檢測(cè)到MSTN mRNA[6,21]。目前，關(guān)于MSTN基因?qū)Τ錾蟮膭?dòng)物肌肉生長發(fā)育調(diào)控機(jī)理尚未完全清楚。前人研究結(jié)果證明，MSTN除在骨骼肌中表達(dá)外[22-25]，在牛心肌細(xì)胞和蒲肯野纖維[23]、豬的乳腺和脂肪組織中也有表達(dá)[26]，另外，在羅非魚的眼、鰓絲、腸、大腦和性腺中也發(fā)現(xiàn)MSTN mRNA[26]。潘英樹等[28]對(duì)MSTN基因在朗德鵝組織中的分布情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，MSTN基因在大腦、小腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、腹脂、皮下脂肪、骨骼肌中均有表達(dá)。胡蘭等[29]檢測(cè)了MSTN基因在大骨雞骨骼肌、心肌、腎臟、腦、腸、舌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MSTN基因在骨骼肌中表達(dá)水平較高，其他組織中有微量表達(dá)，但在肺、肝臟中未檢測(cè)出MSTN mRNA，并且推測(cè)大骨雞孵化后的早期階段骨骼肌生長速度最快，隨著日齡的增加，肌生成抑素水平提高，對(duì)骨骼肌的抑制作用增強(qiáng)。王娜等[30]對(duì)海蘭雞的研究結(jié)果表明，MSTN基因在胸肌、腿肌中的表達(dá)量顯著高于心肌，且胸肌、腿肌表達(dá)量隨著日齡的增加有所上升，28日齡時(shí)達(dá)到最高，心肌之間沒有明顯差異。Ji等[6]報(bào)道了豬妊娠后期胎兒MSTN基因的表達(dá)量顯著提高，出生時(shí)背最長肌的MSTN mRNA豐度顯著降低，到出生后2周時(shí)降到最低水平，隨后MSTN mRNA水平上升，107 kg時(shí)MSTN mRNA上升水平達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，隨后表達(dá)量下降，并且發(fā)現(xiàn)MSTN僅在骨骼肌、心肌組織中表達(dá)。孫偉等[31]對(duì)湖羊的研究結(jié)果顯示，湖羊MSTN基因在肌肉中的表達(dá)在60日齡之前先有增加的趨勢(shì)，60日齡后隨著年齡的增加有減少的趨勢(shì)。

海南黑山羊是中國熱帶地區(qū)優(yōu)良的地方品種，具有耐濕熱、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)，肉質(zhì)優(yōu)良，脂肪分布均勻，膠原蛋白豐富，食物膻味，羊胎素含量高等特點(diǎn)享譽(yù)海內(nèi)外，位列海南省“四大名菜”之首。本試驗(yàn)以海南黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)MSTN基因在其腿肌、腰肌和背肌里不同生長時(shí)期的mRNA表達(dá)差異及發(fā)育性變化規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在所研究的海南黑山羊四個(gè)生長階段，MSTN基因均是在背肌里的表達(dá)量最高，腿肌里的表達(dá)量較低；表達(dá)模式為：背肌>腰肌>腿??；三種肌肉組織均在2月零時(shí)，表達(dá)量較低，3月齡時(shí)極顯著升高(P<0.01)，4月齡時(shí)又極顯著下降(P<0.01)，12月齡時(shí)又極顯著升高(P<0.01)；表達(dá)模式為：腿肌和腰肌的表達(dá)模式為：12月齡>3月齡>4月齡>2月齡；背肌在前三個(gè)階段表達(dá)模式與腿肌和腰肌一致，且在3月齡時(shí)達(dá)到最高水平，而在4月齡又極顯著下降之后(P<0.01)，12月齡時(shí)雖有所上升，但差異不顯著(P>0.05)，表達(dá)模式為：3月零>12月零4月齡>2月齡。由此，本研究認(rèn)為，該基因在不同部位的肌肉組織中均呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，且同一種組織在不同的生長階段呈更復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控模式。根據(jù)前人研究結(jié)果認(rèn)為，MSTN基因在動(dòng)物出生后的肌肉組織中其表達(dá)量并不是隨著日齡的增加而一直增加或下降的趨勢(shì)，而是在某個(gè)時(shí)間分割點(diǎn)對(duì)肌肉的增長起正調(diào)控或負(fù)調(diào)控作用，分割的時(shí)間點(diǎn)在不同物種間可能不同。此外，不同生長階段之間的MSTN基因表達(dá)量大都存在顯著或極顯著差異[30]。本研究由于樣品采集受限，所的數(shù)據(jù)論據(jù)需要更多系統(tǒng)的、連續(xù)性的研究結(jié)果輔助再做進(jìn)一步探討。關(guān)于MSTN基因在海南黑山羊其他生長階段、其他組織中表達(dá)規(guī)律還需要進(jìn)一步研究。

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