孫 鈺，齊玉凱，劉麗英，李顯耀,3*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018;2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018;3.山東省動(dòng)物生物技術(shù)與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018)

Toll樣受體(TLR)是天然免疫系統(tǒng)中一類PRRs(模式識(shí)別受體)，是一類廣泛存在于昆蟲、植物和脊椎動(dòng)物中進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族[1]。TLR4是Toll樣受體家族的重要成員。雞TLR4基因?qū)儆贗型跨膜蛋白受體，位于17號(hào)染色體，全長4 452 bp，包含三個(gè)外顯子，編碼843個(gè)氨基酸[2-3]。TLR4主要識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上的重要成分LPS[4]。Arbour等[5]發(fā)現(xiàn)人TLR4基因的Asp299Gly和Thr399Ile多態(tài)性與吸入LPS后的低應(yīng)答相關(guān)。Lorenz等[6]發(fā)現(xiàn)Asp299Gly和Thr399Ile多態(tài)性在G-細(xì)菌引起的中毒性休克中起一定作用。Leveque等[3]、李鵬等[7]，宋詠梅[8]分析了雞TLR4第三外顯子SNPs及其基因表達(dá)水平與沙門氏菌感染的相關(guān)性?；虻墓δ茏罱K要通過蛋白來行使，TLR4基因的變異也是通過改變TLR4蛋白結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。山東省擁有豐富的地方雞品種資源，如壽光雞、濟(jì)寧百日雞和汶上蘆花雞、瑯琊雞等優(yōu)良品種。這些品種具有肉質(zhì)風(fēng)味好，產(chǎn)蛋量高，性成熟早、抗病力和適應(yīng)性強(qiáng)等突出優(yōu)點(diǎn)[9]。作為生物多樣性的組成部分，地方品種資源基因庫是未來雞品種改良和適應(yīng)生產(chǎn)條件變化的遺傳基礎(chǔ)[10]。本研究擬分析TLR4外顯子SNPs對(duì)TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并檢測(cè)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)具有重要影響的SNPs在地方雞種和商業(yè)雞種中的遺傳變異，進(jìn)一步完善TLR4基因的SNPs信息，為TLR4基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

濟(jì)寧百日雞、萊蕪黑雞、汶上蘆花雞、魯西斗雞、壽光雞均來自原種場(chǎng)，海蘭褐和AA肉雞商品代來自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)雞場(chǎng)，每個(gè)群體隨機(jī)抽取60只雞，翅下靜脈采血1 mL，EDTA抗凝并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

使用血液DNA提取試劑盒提取雞基因組DNA(天根生化科技有限公司，北京)，提取后使用Eppendorf紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 TLR4基因多態(tài)位點(diǎn)的鑒定

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中雞TLR4基因序列(GenBank登錄號(hào)：NC_006104)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)7對(duì)引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。從7個(gè)雞群的420個(gè)DNA樣品中各取1 μL構(gòu)成DNA池。以此為模板，用7對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得TLR4三個(gè)外顯子序列。反應(yīng)體系(25 μL)為2.5 μL 10×PCR buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP (10mM)，上下游引物(10 pM)各0.5 μL，70 μg DNA模板，0.2 μL rTaq酶(5U/μL)和適量無菌水。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，最佳退火溫度(表1)，72℃ 30 s)，最后72 ℃延伸5 min。瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 TLR4基因測(cè)序引物及擴(kuò)增信息Table 1 The primer sequences and amplification condition of TLR4 gene

1.4 TLR4基因多態(tài)位點(diǎn)選擇及基因分型

根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷多態(tài)性位點(diǎn)，并通過單個(gè)個(gè)體直接測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)確認(rèn)的非同義突變通過TMHMM2.0、SOPMA及Protscal軟件在線分析其對(duì)TLR4編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，選擇對(duì)TLR4編碼蛋白具有影響的位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如1.3所述。

1.5 SNP位點(diǎn)的遺傳多樣性分析

利用R軟件中的genetics程序包計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLR4基因多態(tài)位點(diǎn)的鑒定結(jié)果

7對(duì)引物PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明，TLR4基因共檢測(cè)到17個(gè)SNPs位點(diǎn)。其中第一外顯子1個(gè)，第二外顯子2個(gè)，第三外顯子14個(gè)。

2.2 C77T和G247A位點(diǎn)對(duì)TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響

通過分析各SNP位點(diǎn)對(duì)TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C77T和G247A位點(diǎn)對(duì)TLR4編碼蛋白的親水性及跨膜區(qū)有影響(表2)。

由表2可知，C77T位點(diǎn)由C→T發(fā)生改變時(shí)，TLR4編碼蛋白質(zhì)的跨膜螺旋中氨基酸的期望數(shù)目、蛋白質(zhì)前60個(gè)氨基酸的跨膜螺旋氨基酸的期望數(shù)目、N端在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的總概率及該位置的Proscale得分分別增加了1.49、1.38、0.049和0.267，增加比例分別為3.86%、7.60%、6.30%和13.81%；G247A位點(diǎn)堿基改變時(shí)TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果及Proscale得分未有明顯改變。G247A位點(diǎn)由G→A發(fā)生改變時(shí)，TLR4編碼的蛋白質(zhì)中α-螺旋和延伸鏈的比例分別由48.64%升高到54.92%，2.14%升高到2.61%；β-轉(zhuǎn)角及隨機(jī)卷曲的比例由13.29%下降到10.81%，35.94%降到31.55%，C77T位點(diǎn)堿基改變時(shí)對(duì)α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機(jī)卷曲的影響不大。

2.3 TLR4外顯子兩多態(tài)位點(diǎn)的直接測(cè)序結(jié)果

如圖2所示，C77T位點(diǎn)存在GG、GA、AA三種基因型，G247A位點(diǎn)存在CC、TC、TT三種基因型。

2.4 TLR4基因兩位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析

利用直接測(cè)序法對(duì)C77T和G247A位點(diǎn)在7個(gè)不同品種中的基因型進(jìn)行鑒定，計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、多態(tài)信息含量，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

表2 C77T和G247A位點(diǎn)對(duì)TLR4蛋白結(jié)構(gòu)的影響Table 2 The effect of C77T and G247A loci on the structure of TLR4 protein

注：E1. 跨膜螺旋中氨基酸的期望數(shù)目；E2.蛋白質(zhì)前60個(gè)氨基酸的跨膜螺旋氨基酸的期望數(shù)目；P. N端在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的總概率。

Note：E1.The expected number of amino acids in transmembrane helices；E2.The expected number of amino acids in transmembrane helices in the first 60 amino acids of the protein; P. The total probability that the N-term is on the cytoplasmic side of the membrane.

圖1 TLR4外顯子2多態(tài)性位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果a，b分別為C77T，G247A位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果；測(cè)序引物為反向引物Fig.1 The sequencing results of two loci of TLR4 genesa and b are the sequencing results of C77T and G247 loci, respectively；The reverse primer was used for sequencing

C77T多態(tài)位點(diǎn)在7個(gè)雞群中的基因型頻率和等位基因頻率及x2適合性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，CC基因型頻率為0.58～1.00，TT基因型頻率為0～0.03，CT基因型頻率為0～0.38，等位基因C的頻率為0.78～0.99；海蘭褐中所有個(gè)體均為等位基因C，而沒有檢測(cè)到等位基因T。該位點(diǎn)雜合度為0.017～0.352，其中魯西斗雞最低，為0.017，壽光雞最高，為0.352。C77T的多態(tài)信息含量為0.012～0.288，其中壽光雞最高，為0.288。x2適合性檢驗(yàn)表明C77T位點(diǎn)在海蘭褐和汶上蘆花雞兩個(gè)群體中偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，在其余5個(gè)群體中都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

由表4可知，GG基因型頻率為0.07～0.85，AA基因型頻率為0～0.28，AG基因型頻率為0.13～0.90，等位基因G的頻率為0.45～0.92。雜合度為0.154～0.503，其中壽光雞最低，為0.154，海蘭褐和濟(jì)寧百日雞最高，為0.503。該位點(diǎn)PIC在壽光雞中最低，為0.141，在濟(jì)寧百日雞最高，為0.374。x2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明G247A位點(diǎn)在海蘭褐和AA肉雞兩個(gè)商業(yè)品種中偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，在其余5個(gè)地方雞種中都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 TLR4基因C77T位點(diǎn)基因頻率和等位基因頻率的分布Table 3 The frequency distributions of genotype and alleles of C77T locus

表4 TLR4基因G247A位點(diǎn)基因頻率和等位基因頻率的分布Table 4 The frequency distributions of genotypes and alleles of G247A locus

3 討 論

TLR4及其信號(hào)通路在人類疾病中發(fā)揮著重要作用。TLR4在沙門氏菌感染抗性的研究中具有較大優(yōu)勢(shì)，Leveque等[3]對(duì)沙門氏菌易感和抗性品系雞TLR4基因序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)胞外區(qū)第三外顯子中383和611兩個(gè)位點(diǎn)的突變只出現(xiàn)在沙門氏菌易感品系雞中。當(dāng)雞感染沙門氏菌后，盲腸、脾組織中的TLR4基因的表達(dá)量會(huì)增加[11-12]。TLR4的903和1832兩位點(diǎn)的堿基改變，會(huì)引起TLR4與沙門氏菌結(jié)合效率的改變，從而引起機(jī)體的抗感染反應(yīng)[8]。但TLR4基因的突變?cè)斐僧惓１磉_(dá)與抗沙門氏菌感染的關(guān)系和機(jī)制還不清楚。

本研究中，TLR4三個(gè)外顯子在7個(gè)雞群中共存在17個(gè)SNPs，包含10個(gè)同義突變，7個(gè)非同義突變；其中7個(gè)非同義突變?cè)诘谝弧⒍怙@子上各1個(gè)，第三外顯子上5個(gè)。有人在北京油雞等12個(gè)雞群中也檢測(cè)到了位于第一、二外顯子上的C77T和G247A非同義突變位點(diǎn)[8]，與本研究結(jié)果一致。C77T多態(tài)位點(diǎn)，在海蘭褐中僅檢測(cè)到CC型，在其他6個(gè)雞群中該位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率相差不大。在長期的人工選擇和自然選擇中，該位點(diǎn)可能未受到明顯影響。G247A位點(diǎn)在5個(gè)地方雞種中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而在2個(gè)商業(yè)雞種中偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，可能是AA肉雞和海蘭褐在選育過程中所經(jīng)歷的高強(qiáng)度人工選擇影響了該位點(diǎn)的分布。

本研究結(jié)果表明，壽光雞C77T位點(diǎn)的PIC為0.352，屬于中度多態(tài)，其它6種雞群的PIC均為低度多態(tài)，而G247A位點(diǎn)除壽光雞的PIC較低外，其余6個(gè)雞群PIC為0.369～0.374，屬于中度多態(tài)。對(duì)于只有兩個(gè)等位基因的標(biāo)記或基因來說，其最大的多態(tài)信息含量(PIC)只有0.375[13]，該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量較高，可以作為分子標(biāo)記，為下一步進(jìn)行TLR4基因不同基因型與雞革蘭氏陰性菌感染抗性的關(guān)聯(lián)分析提供重要的參考依據(jù)。壽光雞是我國形成歷史較早的地方優(yōu)良品種之一，適應(yīng)性和抗逆性較強(qiáng)，遺傳性能穩(wěn)定[10]。壽光雞TLR4基因2位點(diǎn)PIC與其它6個(gè)雞群的差異是否與其某種生產(chǎn)性能或沙門氏菌抗性有關(guān)，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

雞TLR4蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)功能區(qū)域組成。胞外區(qū)含有大約16～28個(gè)亮氨酸重復(fù)序列(LRR)[14]。LRR特征是亮氨酸間隔分布于幾個(gè)固定位點(diǎn)，可加強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的黏連，有利于LRR參與對(duì)病原微生物或其產(chǎn)物的特征性識(shí)別，進(jìn)而激活TLR4通路[15]。SMART軟件預(yù)測(cè)顯示C77T處于跨膜區(qū)，G247A位于第一個(gè)LRR中，本文通過TMHMM2.0、SOPMA及Protscal軟件分析預(yù)測(cè)C77T和G247A多態(tài)位點(diǎn)的改變對(duì)TLR4所編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜功能有一定的影響，但這種改變是否影響整個(gè)TLR4信號(hào)通路的激活，是否與抗沙門氏菌感染相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

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