陳 婭 綜述 丁涵露 王 莉 審校

蛋白C由PROC基因編碼，位于染色體2q13-q14上，主要由肝臟合成。其功能狀態(tài)為12個氨基酸組成的活性多肽——活化蛋白C(APC)，屬于胰島素樣絲氨酸蛋白酶家族，正常血漿含量約40 pM，半衰期約15 min［1］。目前常通過轉(zhuǎn)基因或基因缺失的動物模型來研究APC的作用效應。血漿APC的含量及存在方式檢測主要采用發(fā)色底物法、酶聯(lián)免疫吸附法或放射免疫法等，學者們通過不斷改進的檢測方式，進一步完善對APC的生物學結(jié)構(gòu)功能認識?，F(xiàn)將APC的研究進展作一綜述。

蛋白C/APC的結(jié)構(gòu)

蛋白C由γ羧基谷氨酸域、直接連接的2個EGF域、胰島素樣絲氨酸蛋白酶區(qū)組成［2］。其絲氨酸蛋白酶域在凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白(T-TM)復合物作用下產(chǎn)生APC發(fā)揮生物學功能(圖1)。APC活性區(qū)由絲氨酸蛋白酶區(qū)上的 His211、Asp257和Ser360組成，功能主要集中在N端的谷氨酸域和C端的絲氨酸蛋白酶域。

APC的生物學功能

APC與功能受體 蛋白C有效活化需要血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)和內(nèi)皮細胞蛋白C受體(EPCR)。TM與凝血酶有高度親和力，促使APC的形成，其中EPCR通過結(jié)合蛋白C并呈遞TM-T復合物進一步加快APC的形成，APC與受體EPCR解離后發(fā)揮抗凝作用，而發(fā)揮細胞保護作用則需要EPCR和蛋白酶活化受體1(PAR-1)的參與。EPCR有跨膜和可溶性兩種形式。炎癥狀態(tài)時，血漿中可溶性EPCR上調(diào)，與APC結(jié)合后抗凝活性消失，能被活化白細胞膜上表達的蛋白酶3識別、裂解及滅活，蛋白酶3的功能尚不清，可能與滅活蛋白 C途徑有關(guān)［3］。Pérez-Casal等［4］用外源性 APC 處理單核細胞或內(nèi)皮細胞時，發(fā)現(xiàn)微粒體上的EPCR與APC結(jié)合增多，阻斷細胞表面EPCR后，其抗凝及細胞保護作用仍存在。膿素癥患者APC治療時，循環(huán)中微粒體上的EPCR-APC復合物含量增加，并通過激活PAR-1和上調(diào)1磷酸鞘氨醇(S1P)發(fā)揮抗凋亡及內(nèi)皮保護作用［5］，但其確切機制有待進一步研究。另外，PAR-1也是APC實施生物功能的重要組成部分，是一個7-跨膜結(jié)構(gòu)域的 G蛋白偶聯(lián)受體，EPCR和PAR-1在內(nèi)皮上共區(qū)域化是調(diào)節(jié)APC保護信號的關(guān)鍵。

圖1 APC在內(nèi)皮細胞活化過程及發(fā)揮生物學功能的通路

APC的抗凝作用 APC是一個重要的抗凝因子，主要通過滅活凝血因子FVa和FⅧa的活性發(fā)揮抗凝作用，蛋白S、FV、高密度脂蛋白、陰離子磷脂和鞘糖脂協(xié)助APC的抗凝功能［6］。血漿內(nèi)源性蛋白C抑制物(PCI)、α12抗胰蛋白酶和α22巨球蛋白與APC的谷氨酸域結(jié)合率高，使其血漿含量減低，抑制APC的抗凝效能。另一方面，APC促進內(nèi)皮細胞釋放纖溶酶原激活物，同時抑制纖溶酶原激活物抑制因子l(PAI-1)和凝血酶激活的纖溶抑制因子(TAFI)，從而激活纖溶系統(tǒng)［2］。

APC的抗炎作用 APC除了通過抗凝發(fā)揮間接的抗炎作用外，還可干預細胞釋放促炎癥因子及炎癥細胞的作用發(fā)揮直接的抗炎效應。炎癥狀態(tài)下，APC阻斷核因子 κB(NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)炎性蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平，從而減少炎性因子及趨化因子［7］。還能抑制脂多糖誘導的白細胞介素 6(IL-6)、IL-8、IL-1B 及腫瘤壞死因子 α(TNF-α)產(chǎn)生。并可通過抑制活性蛋白1(AP-1)家族c-Fos和Fos B中炎性轉(zhuǎn)錄因子的表達，下調(diào)趨化因子及黏附因子的表達，以縮小炎癥范圍［2］。人臍靜脈內(nèi)皮細胞實驗研究顯示，APC能促進環(huán)氧化酶2(COX-2)產(chǎn)生抗炎介質(zhì)前列腺素 I2，也可通過PAR-1和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)途徑刺激血單核細胞分泌抗炎因子IL-10，從而抵消促炎癥因子［8］。體外實驗也證實APC明顯降低粒細胞在趨化因子作用下的移動能力，下調(diào)整聯(lián)蛋白介導的粒細胞遷移，從而減少炎癥區(qū)域中性粒細胞集聚［7］。

APC的抗凋亡作用 APC與EPCR結(jié)合，激活PAR-1通路實現(xiàn)抗凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)APC通過減低Bax/Bcl-2促凋亡比值及caspase-3的活性來限制N-甲基-D-天冬氨酸誘導的興奮毒性損傷引起的神經(jīng)凋亡的發(fā)生［2］。人類大腦內(nèi)皮細胞在低氧條件下，APC通過減少P53蛋白發(fā)揮抗凋亡作用。在膿毒癥鼠模型中，APC-EPCR復合物激活 PAR-1［9］，緩解活性氧簇和亞硝酸鹽對呼吸鏈復合物的破壞，抑制線粒體損傷凋亡。同時，APC能刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞表達B細胞淋巴瘤2-L1(BCL2L1)、前列腺素過氧化物合酶2(PTGS2)等抗凋亡因子，而抑制促凋亡基因的表達。Pérez-Casal［4］等也發(fā)現(xiàn)經(jīng)外源性APC通過上調(diào)抗凋亡基因，抑制十字孢堿誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡作用。O'Brien等［9］也證實APC抑制TNF相關(guān)的凋亡誘導配體(TRAIL)，導致細胞凋亡受阻。當然，APC介導的復雜凋亡信號途徑尚需更多研究證實。

APC介導的內(nèi)皮細胞屏障穩(wěn)定作用 APC通過EPCR依賴的PAR-1激活，刺激鞘氨醇激酶1(SphK-1)形成血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)定物——S1P，保護內(nèi)皮屏障。S1P激活S1P受體1(S1P1)，保護細胞骨架的穩(wěn)定性，加強內(nèi)皮細胞之間的縫隙連接，保護內(nèi)皮屏障［7］。其中活化S1P1依賴于磷酸脂酰肌醇3-激酶途徑。目前，APC激活PAR-1產(chǎn)生內(nèi)皮保護功能的機制仍不清楚。多位學者發(fā)現(xiàn)APC在Arg46位點裂解 PAR-1 介導內(nèi)皮屏障穩(wěn)定信號［10，11］。Pérez-Casal等［4］在人臍靜脈內(nèi)皮實驗中發(fā)現(xiàn) S1P 信號途徑可磷酸化激酶插入?yún)^(qū)受體(KDR)，通過特異性阻斷KDR作用時，其APC完全失去內(nèi)皮保護作用。最近發(fā)現(xiàn)，APC激活PAR-1發(fā)揮內(nèi)皮屏障保護功能是依賴β抑制蛋白，通過干預β抑制蛋白表達時，APC誘導的內(nèi)皮保護信號被阻斷，但不能阻斷凝血酶誘導的內(nèi)皮屏障破壞，研究證實了β抑制蛋白在APC信號通路中的重要性［12］。另外，APC能減少凝血酶誘導的蛋白高滲出，改善氧自由導致的內(nèi)皮屏障通透性增加，同時減少炎性介質(zhì)及黏附因子對血管內(nèi)皮的損傷［2］。

APC相關(guān)變異體的研究

為明確APC功能與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，學者對其多種突變體進行了研究。Gla域殘基的誘變確定了Gla域與APC抗凝活性密切相關(guān)，顯示出leu8是APC結(jié)合EPCR關(guān)鍵的氨基酸。RR229/230AA和KKK191-193AAA不能裂解FVa減少了抗凝活性，但仍發(fā)揮的細胞保護活性，也相應說明了APC獨立于抗凝的細胞保護作用［7］。將APC環(huán)上的37和70所帶正電荷群抵消，可阻滯APC和FVa間的相互作用，從而消除抗凝活性。近來研究發(fā)現(xiàn)，APC的自溶環(huán)對FⅧa的滅活也很重要，R306、K311和R314的突變導致 FⅧa的滅活明顯減少［13］。Bae等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在Cys67和Cys82之間增加一個二硫鍵，可穩(wěn)定Ca2+結(jié)合環(huán)和提高APC的抗凝活性，然而降低了APC的細胞保護作用。丙氨酸取代GLU-167和GLU-170不影響抗凝活性，而抗?jié)B透性和抗炎效應將丟失。Mosnier等［15］發(fā)現(xiàn)，C末端的突變(E149A)，剝奪了APC的細胞保護功能，然而增加了抗凝活性。近期Pozzi等［16］發(fā)現(xiàn)E160A/D167A/D172A的APC突變體能提高凝血酶激活率，且速度比野生型蛋白C快63倍。這些不同變異體的研究顯示了APC的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的重要性，并展現(xiàn)出APC的多效的生物學功能。

APC與糖尿病腎病(DN)

糖尿病(DM)患病率呈逐年迅速上升趨勢，其中15%～40%的DM患者發(fā)生DN。研究發(fā)現(xiàn)在DM患者血栓調(diào)節(jié)蛋白從內(nèi)皮上丟失，導致蛋白C活化受限，至血漿 APC不同程度的下降［17］。為了解釋APC與DN的關(guān)系，Isermann等［18］通過基因工程獲得APC活化受阻和APC高表達的DN小鼠模型，28周后APC活化受限組出現(xiàn)嚴重的蛋白尿及腎小球細胞外基質(zhì)的增生。相反，高表達APC組蛋白尿明顯減少。同時，APC抑制腎皮質(zhì)中高糖誘導的P53和Bax蛋白的表達及內(nèi)皮細胞和足細胞的凋亡。最近研究發(fā)現(xiàn)APC的腎臟保護作用依賴caveolin-1的脫磷酸的PAR-3的激活，并發(fā)現(xiàn)APC減輕脂多糖誘導的系膜損傷和蛋白尿［19］。Gil-Bernabe等［20］給 DN 小鼠腹腔注入 APC，一月后與未處理組比較發(fā)現(xiàn)，血尿素氮與血清肌酐、尿總蛋白與肌酐比及尿蛋白水平明顯改善。腎組織中的單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的濃度減少，且血小板衍生因子(PDGF)、TGF-β1和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的RNA表達水平明顯降低，凋亡細胞百分比也相應減少。Xue等［21］研究發(fā)現(xiàn)，予重組APC干預的NOD小鼠，DM的發(fā)生率從70%(對照組)降至7.6%，并促進了胰島素的表達，推測APC可能有直接的胰島β細胞的保護作用［21］。目前關(guān)于APC在DN中作用的研究，在一定程度上說明APC減少是DM腎小球毛細血管功能紊亂的一個潛在機制。

DN患者發(fā)生心血管疾病風險增高，其機制尚不十分明確，除了傳統(tǒng)的危險因素，目前研究發(fā)現(xiàn)APC在DN患者動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用。曾有研究報道APC抵抗與動脈粥樣硬化有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)DM患者APC產(chǎn)生明顯下降，且APC水平下降與動脈粥樣硬化進展、頸動脈內(nèi)-中膜厚度(IMT)呈負相關(guān)［22］。APC下降會削弱內(nèi)皮細胞對抗凋亡、氧化應激、炎癥的能力，使DM血管內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能紊亂更加嚴重，導致動脈粥樣硬化快速發(fā)展。但對于APC與DN動脈粥樣硬化關(guān)系的研究大多來源于動物模型，其發(fā)生發(fā)展的作用尚需進一步研究明確。

小結(jié):APC具有抗凝、抗炎、抗凋亡及保護內(nèi)皮屏障的生物學功能，改善多種疾病的結(jié)局及預后。研究證實，APC能延緩DN發(fā)展，與DN常見并發(fā)癥動脈粥樣硬化的程度呈負相關(guān)，但目前確切的發(fā)生機制及延緩措施尚不清楚。因此，需進一步研究APC在DN患者動脈粥樣硬化中的作用機制和功能，使APC成為可能的干預手段。

1 Tran S，Dahlb?ck B.Novel APC-cleavage sites in FVa provide insights into mechanisms of action of APCand its cofactor protein S.JThromb Haemost，2010，8(1):129-136.

2 Neyrinck AP，Liu KD，Howard JP，et al.Protective mechanisms of activated protein C in severe inflammatory disorders.Br J Pharmacol，2009，158(4):1034-1047.

3 Villegas-Mendez A，Montes R，Ambrose LR，et al.Proteolysis of the endothelial cell protein C receptor by neutrophil proteinase 3.J Thromb Haemost，2007，5(5):980-988.

4 Pérez-Casal M，Downey C，Cutillas-Moreno B，et al.Microparticleassociated endothelial protein C receptor and the induction of cytoprotective and anti-inflammatory effects.Haematologica，2009，94(3):387-394.

5 Andriantsitohaina R.Microparticles as biological vectors of activated protein Ctreatment in sepsis.Crit Care，2011，15(5):197.

6 Griffin JH，Zlokovic BV，Mosnier LO.Protein C anticoagulant and cytoprotective pathways.Int JHematol，2012，95(4):333-345.

7 Sarangi PP，Lee HW，Kim M.Activated protein C action in inflammation.Br J Haematol，2010，148(6):817-833.

8 Galley HF，El Sakka NE，Webster NR，et al.Activated protein C inhibits chemotaxis and interleukin-6 release by human neutrophils without affecting other neutrophil functions.Br J Anaesth，2008，100(6):815-819.

9 O'Brien LA，Richardson MA，Mehrbod SF，et al.Activated protein C decreases tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand by an EPCR-independent mechanism involving Egr-1/Erk-1/2 activation.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(12):2634-2641.

10 Mosnier LO，Sinha RK，Burnier L，et al.Biased agonism of proteaseactivated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46.Blood，2012，120(26):5237-5246.

11 Schuepbach RA，Madon J，Ender M，et al.Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects.J Thromb Haemost，2012，10(8):1675-1684.

12 Soh UJ，Trejo J.Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling throughβ-arrestin and dishevelled-2 scaffolds.Proc Natl Acad Sci U SA，2011，108(50):1372-1380.

13 Cramer TJ，Gale AJ.Function of the activated protein C(APC)autolysis loop in activated FVIII inactivation.Br J Haematol，2011，153(5):644-654.

14 Bae JS，Yang L，Manithody C，et al.Engineering a disulfide bond to stabilize the calcium-binding loop of activated protein Celiminates its anticoagulant but not its protective signaling properties.J Biol Chem，2007，282(12):9251-9259.

15 Mosnier LO，Zampolli A，Kerschen EJ，et al.Hyperantithrombotic，noncytoprotective Glu149Ala-activated protein C mutant.Blood，2009，113(23):5970-5978.

16 Pozzi N，Barranco-Medina S，Chen Z，et al.Exposure of R169 controls protein C activation and autoactivation.Blood，2012，120(3):664-670.

17 Brosius FC，Khoury CC，Buller CL，et al.Abnormalities in signaling pathways in diabetic nephropathy.Expert Rev Endocrinol Metab，2010，5(1):51-64.

18 Isermann B，Vinnikov IA，Madhusudhan T，et al.Activated protein C protects against diabetic nephropathy by inhibiting endothelial and podocyte apoptosis.Nat Med，2007，13(11):1349-1358.

19 Madhusudhan T，Wang H，Straub BK，et al.Cytoprotective signaling by activated protein C requires protease-activated receptor-3 in podocytes.Blood，2012，119(3):874-883.

20 Gil-Bernabe P，D'Alessandro-Gabazza CN，Toda M，et al.Exogenous activated protein C inhibits the progression of diabetic nephropathy.J Thromb Haemost，2012，10(3):337-346.

21 Xue M，Dervish S，Harrison LC，et al.Activated protein C inhibits pancreatic islet inflammation，stimulates t regulatory cells，and prevents diabetes in non-obese diabetic(NOD)mice.J Biol Chem，2012，287(20):16356-16364.

22 Matsumoto K，Yano Y，Gabazza EC，et al.Inverse correlation between activated protein C generation and carotid atherosclerosis in Type 2 diabetic patients.Diabet Med，2007，24(12):1322-1328.