2006年，Grant等[1]使用定位克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了2型糖尿病(T2DM)的第2個易感基因——轉(zhuǎn)錄因子7樣2基因(TCF7L2)，該基因位于10 號染色體，是迄今在歐洲、印第安、美國及亞洲人群等世界范圍內(nèi)重復性最好的糖尿病易感基因[1-3]。由于TCF7L2多態(tài)性顯示出強烈的易感效應(yīng)，得到了各國學者的廣泛關(guān)注。Kang等[4]研究結(jié)果提示TCF7L2 rs7903146與韓國腎移植后糖尿病(PTDM)的發(fā)病顯著相關(guān)。比利時的Ghisdal等[5]研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2 rs7903146的T等位基因與PTDM顯著相關(guān)。但Chang等[6]對中國臺灣漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs7903146在中國人群中較少見，且rs7903146與中國人群T2DM無相關(guān)性，反而是位于內(nèi)含子7的rs290487 與T2DM顯著相關(guān)，這可能與不同人群在遺傳背景上的差異所致[7]。Ren等[8]對我國漢族人群的研究則提示rs290487 與T2DM無顯著相關(guān)性(P=0.071)。TCF7L2基因多態(tài)性與中國人群PTDM的相關(guān)性目前尚未見報道，基于以上對中國人群TCF7L2基因各位點多態(tài)性與T2DM相關(guān)性的研究結(jié)果，本研究選取了rs290487位點，采用實時熒光定量PCR方法，檢測了398例中國腎移植患者rs290487的基因型和突變頻率，分析該基因多態(tài)性與PTDM的相關(guān)性，探討TCF7L2基因是否為PTDM的易感基因。

對象和方法

研究對象1998年～2008年在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院進行同種異體腎移植術(shù)的受者496例，排除術(shù)前合并糖尿病10例，術(shù)后失訪68例，再次腎移植13例，術(shù)后第1周死亡4例和術(shù)后第1月移植腎失功3例，共398例受者入組。均采用以環(huán)孢素或他克莫司為基礎(chǔ)的三聯(lián)免疫抑制治療方案。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會的診斷標準，腎移植術(shù)后受者的空腹血糖(FPG) ≥7 mmol/L或使用了降糖藥(胰島素或口服降糖藥)即診斷為PTDM，納入PTDM組，其他患者納入移植后非糖尿病組(對照組)，所有研究對象均詳細記錄性別、身高、移植時年齡和體重、原發(fā)腎臟病、移植時間、糖尿病家族史、透析時間、吸煙史、乙型肝炎和丙型肝炎感染史、高血壓病史、尸腎或親屬移植、詳細的免疫抑制治療方案(如劑量和濃度)、肝腎功能、FPG、血脂、血壓。

儀器與試劑7900HT 快速實時定量PCR儀(ABI)；離心機(Heraeus高速離心機)，WH-1 微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。Wizard DNA提取試劑盒(Promega)、TaqMan? Universal PCR Master Mix(ABI)、TaqMan? SNP Genotyping Assays(rs290487，ABI)。其余試劑為分析純，蒸餾水經(jīng)重蒸餾處理。

DNA提取與測定采用全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

TCF7L2 rs290487基因型檢測采用TaqMan探針法實時定量PCR檢測。SNP Genotyping Assays由ABI公司提供，使用FAM和VIC作為探針的熒光標記。PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix(AmpliTaq Gold DNA 聚合酶，AmpErase UNG酶，帶dUTP的dNTP，內(nèi)參1，優(yōu)化的緩沖液)2.5 μl，40×SNP Genotyping Assays 0.125 μl，DNA模板1.0 μl，無酶水(Nuclease-Free water)補足至5 μl。PCR反應(yīng)條件：變性95℃，10 min；循環(huán)92℃ 15s，60℃ 1 min，40次。

統(tǒng)計學處理采用Hardy-Weinberg平衡檢測基因型的分布是否具有代表性，PTDM組和對照組兩組間等位基因和各基因型頻率的差異采用χ2檢驗。采用Logistic 回歸分析PTDM發(fā)病的危險因素，各變量與PTDM的關(guān)系采用單變量Logistic回歸分析，單變量分析有意義的變量再采用Backward Stepwise (Likelihood Ratio)方法進行多變量Logistic回歸分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結(jié) 果

PTDM組和對照組患者的一般情況比較398例入組的腎移植受者中，97例診斷為PTDM。PTDM組和對照組受者的一般情況見表1。PTDM組患者的透析時間、移植時的年齡、體重、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、男性患者比例均高于對照組(P<0.05或P<0.01)，兩組使用他克莫司的患者比例和移植前的FPG水平無差異。

表1 PTDM組與對照組受者腎移植前一般資料

兩組患者rs290487等位基因和基因型頻率分布PTDM組和對照組的CC基因型分別為27.8％和18.3％，TT基因型分別為26.8％和39.2％，兩組的基因型分布存在顯著差異(P=0.039)，PTDM組CC基因型頻率明顯高于對照組，而TT基因型頻率明顯低于對照組(表2)。

表2 兩組患者rs290487基因型分布比較

rs290487的基因分布符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。PTDM組和對照組患者的C等位基因頻率分別為50.5％和39.5％，T等位基因頻率分別為49.5％和60.5％，PTDM組的C等位基因頻率明顯高于對照組，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008)(表3)。

表3 兩組患者rs290487等位基因頻率比較

TCF7L2基因rs290487與PTDM相關(guān)性在單因素Logistic回歸中，將TCF7L2基因rs290487納入變量分析結(jié)果顯示，CC基因型攜帶者移植術(shù)后發(fā)生PTDM的風險是TT基因型攜帶者的2.353倍(95％CI：1.262～4.390，P=0.007)；用性別和移植時年齡等危險因素進行校正后[9]，CC基因型攜帶者移植術(shù)后發(fā)生PTDM的風險是TT基因型攜帶者的2.411倍(95％CI：1.263～4.605，P=0.008)(表4)。本課題的前期研究結(jié)果表明[9]，男性(OR=2.104，P=0.009)、年齡 (OR=1.041，P<0.001)、體重(OR=1.040，P=0.001)和BMI (OR=1.142，P<0.001)均是PTDM發(fā)病的危險因素，因此，在多因素Logistic回歸中，用性別、移植時年齡、體重和BMI等進行校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CC基因型仍是腎移植后發(fā)生PTDM的危險因素(表4)。

合并CC基因型和CT基因型，進行Logistic回歸分析，結(jié)果表明，CC和CT基因型攜帶者腎移植術(shù)后發(fā)生PTDM的風險是TT基因型攜帶者的1.761倍(95％CI：1.062～2.919，P=0.028)；用性別和移植時年齡進行校正后，其OR=1.915(95％CI：1.136～3.228，P=0.015)；用性別、移植時年齡、體重和BMI進行校正后，其OR=1.935(95％CI：1.141～3.281，P=0.014)。該結(jié)果表明TCF7L2基因rs290487的C等位基因是腎移植后發(fā)生PTDM的獨立危險因素。

表4TCF7L2rs290487與PTDM相關(guān)性的Logistic回歸分析結(jié)果

TCFTL2：轉(zhuǎn)錄因子7樣2基因；PTDM：腎移植后糖尿??；a：用性別和年齡進行校正；b：用性別，年齡，體重和BMI進行校正

討 論

研究表明，TCF7L2由胰腺β細胞表達，與胰島素分泌有關(guān)[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)非洲裔美國人和西非人TCF7L2基因多態(tài)性與T2DM相關(guān)[7,11]，但對北非人的研究結(jié)果卻與此不一致[12]。Peng等[13]的Meta-analysis納入了全球155項相關(guān)研究的121 174個病例-對照結(jié)果表明，rs7903146、rs12255372、rs11196205、rs7901695、rs7895340和rs4506565均與T2DM顯著相關(guān)(P<0.05)，但未發(fā)現(xiàn)rs290487、rs11196218與T2DM的相關(guān)性。

Kang等[4]研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2 rs7903146與韓國腎移植患者PTDM的發(fā)病顯著相關(guān)，CT基因型是其高危因素(OR=2.655，P=0.020)。Ghisdal等[5]的研究結(jié)果證實了TCF7L2 rs7903146位點的多態(tài)性與比利時腎移植患者術(shù)后發(fā)生PTDM顯著相關(guān)。但Chang等[6]對臺灣人群的研究顯示，rs7903146在中國人群中較少見，且與中國人群T2DM無相關(guān)性， 而rs290487位點與T2DM明顯相關(guān)，其CT和CC基因型的OR值分別為1.3和1.51(P<0.01)。目前國內(nèi)對該位點的相關(guān)研究結(jié)果尚存在爭議[14]。據(jù)報道，TCF7L2基因rs290487與遼寧[15]、濟南[16]漢族人群及北京漢族人群[8]T2DM無相關(guān)性，與安徽地區(qū)漢族人群[17]和哈爾濱人群[18]T2DM則顯著相關(guān)(P<0.05)。

根據(jù)以上研究結(jié)果，本研究檢測了399例腎移植受者的TCF7L2 rs290487多態(tài)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)， C等位基因頻率為39.5％～50.5％，明顯高于遼寧[15]、濟南[16]及安徽地區(qū)人群[17]，而且，PTDM組的C等位基因頻率明顯高于對照組(50.5％vs39.5％，P=0.008)，該結(jié)果與臺灣人群[6]中糖尿病組和正常對照組的基因頻率(42％vs36％)分布趨勢基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，PTDM組CC基因型頻率明顯高于對照組，也明顯高于國內(nèi)普通人群和T2DM人群[15-18]。Logistic回歸分析結(jié)果表明，rs290487的C等位基因是腎移植術(shù)后發(fā)生PTDM的獨立危險因素，與對臺灣人群[6]和安徽地區(qū)漢族人群[17]普通糖尿病的研究結(jié)果一致。

TCF7L2屬于核受體家族，間接介導Wnt信號傳導通路[19]。在胚胎發(fā)育過程中,胰腺和胰島的正常發(fā)育有賴于準確的Wnt信號傳導。TCF7L2 rs290487位點突變，影響了Wnt信號轉(zhuǎn)導通路的級聯(lián)反應(yīng)，可抑制腸內(nèi)分泌L細胞胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的表達，使機體血糖升高，從而導致糖尿病[20]。另一方面，TCF7L2與胰島B細胞功能缺陷、快速急性相胰島素分泌不足相關(guān)，該位點突變還可影響TCF7L2 及其他胰島素相關(guān)基因的表達，從而抑制機體胰島素的釋放[21-23]。因此TCF7L2的變異可能通過直接和間接途徑導致胰島細胞分泌胰島素不足及胰島B細胞數(shù)量的下降。TCF7L2變異個體的表型為糖刺激后胰島素分泌不足,但內(nèi)含子的變異引起TCF7L2在胰島B細胞表達異常及異常表達的TCF7L2蛋白如何直接降低胰島素的分泌機制目前還不明確。而且，糖尿病是一種多基因遺傳病,多個微效基因的累加作用及環(huán)境因素造成攜帶致病基因個體對糖尿病的遺傳易感性,其中單個基因的突變對疾病的發(fā)生起很小的作用，需綜合考慮整體因素的影響。

本研究納入398例腎移植患者，樣本量相對較小，而且基本是湖北漢族人，中國地域遼闊、民族眾多，其他地區(qū)和民族的TCF7L2rs290487多態(tài)性是否與PTDM相關(guān)還需要進一步研究證實。

1 Grant SF,Thorleifsson G,Reynisdottir I,et al.Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.Nat Genet,2006,38(3):320-323.

2 T?njes A,Stumvoll M.The role of the Pro12Ala polymorphism in peroxisome proliferator- activated receptor gamma in diabetes risk.Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2007,10(4):410- 414.

3 Van Dam RM,Hoebee B,Seidell JC,et al.Common variants in the ATP sensitive K+channel genes KCN(Kir6.2)and ABCC8(SUR1) in relation to glucose intolerance：population- based studies and meta- analysis.Diabet Med,2005,22(5):590- 598.

4 Kang ES,Kim MS,Kim YS,et al.A Variant of the Transcription Factor 7-Like 2 (TCF7L2) Gene and the Risk of Posttransplantation Diabetes Mellitus in Renal Allograft Recipients.Diabetes Care,2008,31(1):63-68.

5 Ghisdal L,Baron C,Le Meur Y,et al.TCF7L2 polymorphism associates with new-onset diabetes after transplantation.J Am Soc Nephrol,2009,20(11):2459-2467.

6 Chang YC,Chang TJ,Jiang YD,et al.Association study of the genetic polymorphisms of the transcription factor 7-like 2(TCF7L2) gene and type 2 diabetes in the Chinese population.Diabetes,2007,56(10):2631-2637.

7 Helgason A,Pálsson S,Thoreifsson G,et al.Refining the impact of TCF7L2 gene variants on type 2 diabetes and adaptive evolution.Nat Genet,2007,39(2):218- 225.

8 Ren Q,Han XY,Wang F,et al.Exon sequencing and association analysis of polymorphisms in TCF7L2 with type 2 diabetes in a Chinese population.Diabetologia,2008,51(7):1146-1152.

9 Yu AR,Xin HW,Wu XC,et al.Adiponectin gene polymorphisms are associated with posttransplantation diabetes mellitus in Chinese renal allograft recipients.Transplant Proc,2011,43(5):1607-1611.

10 Le Bacquer O,Shu L,Marchand M,et al.TCF7L2 splice variants have distinct effects on beta-cell turnover and function.Hum Mol Genet,2011,20(10):1906-1915.

11 Yan Y,North KE,Ballantyne CM,et al.Transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) polymorphism and context-specific risk of type 2 diabetes in African American and Caucasian adults:The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study.Diabetes,2009,58(1):285-289.

12 Alsmadi O,Al-Rubeaan K,Mohamed G,et al.Weak or no association of TCF7L2 variants with type 2 diabetes risk in an Arab population.BMC Med Genet,2008,9:72.

13 Peng S,Zhu Y,Lü B,et al.TCF7L2 gene polymorphisms and type 2 diabetes risk:a comprehensive and updated meta-analysis involving 121174 subjects.Mutagenesis,2013,28(1):25-37.

14 Zhang BC,Li WM,Zhu MY,et al.Association of TCF7L2 gene polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in Han Chinese population:a meta-analysis.Gene,2013,512(1):76-81.

15 紀紅梅,劉 巍,邊 澈,等.TCF7L2 基因rs290487多態(tài)性與遼寧地區(qū)2型糖尿病發(fā)病的相關(guān)性.中國生物制品學雜志,2012,25(6):740-742.

16 張 勇,榮海欽,王 輝,等.TCF7L2基因rs290487多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)研究.實用糖尿病雜志,2009,5(3):27-29.

17 朱 暉,王佑民,許 敏,等.生物芯片快速檢測糖尿病風險基因TCF7L2 rs290487位點.安徽醫(yī)科大學學報,2011,46(1):20-23.

18 Qiao H,Zhang X,Zhao X,et al.Genetic variants of TCF7L2 are associated with type 2 diabetes in a northeastern Chinese population.Gene,2012,495(2):115-119.

19 Ip W,Shao W,Chiang YT,et al.The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 is upregulated by insulin and represses hepatic gluconeogenesis.Am J Physiol Endocrinol Metab,2012,303(9):E1166-1176.

20 Jin T,Liu L.The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 and type 2 diabetes mellitus.Mol Endocrinol,2008,22(11):2383-2392.

21 Palmer ND,Lehtinen AB,Langefeld CD,et al.Association of TCF7L2 gene polymorphisms with reduced acute insulin response in Hispanic Americans.J Clin Endocrinol Metab,2008,93(1):304-309.

22 Savic D,Ye H,Aneas I,et al.Alterations in TCF7L2 expression define its role as a key regulator of glucose metabolism.Genome Res,2011,21(9):1417-1425.

23 Mondal AK,Das SK,Baldini G,et al.Genotype and tissue-specific effects on alternative splicing of the transcription factor 7-like 2 gene in humans.J Clin Endocrinol Metab,2010,95(3):1450-1457.