劉愛琴 葉河江 路雪婧

2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科

3成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科

光化學(xué)損傷是視網(wǎng)膜光損傷中最普遍的一種損傷。其病理過程與年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病有許多相似之處，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡，是一個退行性變性過程〔1〕。多焦視網(wǎng)膜電圖（multifocal electroretinogram，mfERG）的一階反應(yīng)能較好反應(yīng)大鼠視網(wǎng)膜功能的損傷程度〔2〕。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷模型作為研究對象，通過mfERG觀察研究枸杞子、菟絲子、五味子、茺蔚子、楮實(shí)子（下稱明目“五子”）對視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷及損傷修復(fù)的影響，并探討其對視網(wǎng)膜功能的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與儀器、藥品

選用8周齡SD大鼠32只，雌性，體重150～170 g。動物由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（生產(chǎn)合格證號：川實(shí)動管質(zhì)第99-11號）。多焦電生理系統(tǒng)為德國 Roland公司生產(chǎn)的 RETIscan（Version 3.11）視誘發(fā)反應(yīng)圖象系統(tǒng)。中藥“五子”以常規(guī)劑量制成水煎劑。

1.2 分組及給藥方法

隨機(jī)選取8只大鼠作為正常對照組，其余24只造模后隨機(jī)分為模型對照組、明目五子高劑量組、低劑量組，每組各8只。高、低劑量組：分別以臨床成人劑量20倍（13 g生藥/kg）、10倍（6.5 g生藥/kg）的“五子”水煎劑灌胃，1次/d。模型對照組、正常對照組以中藥等容量的生理鹽水灌胃，1次/d。光照同時給藥，共 14 d。

1.3 造模方法

參照文獻(xiàn)〔3〕，采用自制光化學(xué)損傷裝置。在光照架的6個面分別放置1根40 W的綠色熒光燈管（波長510～560 nm）。光照箱中心各方向平均照度為（1900±106.9）Lux，相當(dāng)于大鼠正常活動時眼球水平的各箱壁的照度為2000Lux。動物房的室溫控制在21～24℃，光照箱內(nèi)的平均溫度為22～25℃。所有實(shí)驗(yàn)動物在12 h明視（30～50lux）及 12 h暗視環(huán)境光照維持，自由攝食飲水，馴養(yǎng)10 d。10 d后將大鼠暗適應(yīng)24 h，然后進(jìn)入光照箱，接受24 h光照。大鼠不散瞳不麻醉，可在光照箱內(nèi)自由活動，光照后送回暗環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.4 測試指標(biāo)及方法

給予中藥“五子”灌胃14 d后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.4.1 mfERG測定：用1.5 ml/kg的3%戊巴比妥鈉行SD大鼠左下腹腔注射全麻，被檢測眼托吡卡胺滴眼液充分散瞳，同時予1%的卡因點(diǎn)眼角結(jié)膜表面麻醉。大鼠暗適應(yīng) 20分鐘后，采用 Ball法〔9〕，刺激采用圖形同心圓排列的61個六角形，用21寸顯示器顯示。61個六角形由計算機(jī)產(chǎn)生二進(jìn)制m-序列的假隨機(jī)序列交替顯示亮幀和暗幀，單位格的局部ERG反應(yīng)由計算機(jī)自動處理記錄。刺激采用1∶4亮暗對比，即1個亮幀接著有4個暗幀，暗幀之后每個六角形按m-序列隨機(jī)出現(xiàn)亮暗幀，反復(fù)進(jìn)行，47 s一個時段，每次測試共記錄4個時段。通頻帶5 Hz～300 Hz。各電極均與針灸針相連，R+極針灸針刺入角膜下方邊緣，R-極針灸針于兩眼眶上緣連線中點(diǎn)刺入皮下，針尖與骨膜相貼，地電極置于尾根部皮下。信號經(jīng)放大器放大（×10 000）并濾過（1 Hz/1 kHz）。所有mfERG反應(yīng)曲線均以第一個大的負(fù)波和正波，即N1波和P1波為分析對象。采用常規(guī)分析參數(shù)，即各同心環(huán)反應(yīng)波進(jìn)行分析。數(shù)值以各波反應(yīng)密度（即單位面積的振幅值，nV/deg2）及各波潛時（ms）表示。

1.4.2 光鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞凋亡：各組過量麻醉大鼠，角膜12點(diǎn)位縫線標(biāo)記，立即摘除眼球（包括球后視神經(jīng)2 mm），角膜穿通一小切口，浸泡于15%甲醛組織固定液中。24小時后沿標(biāo)記縫線-視神經(jīng)連線對剖眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視盤顳側(cè)旁開1 mm做4 μm厚的切片，烘干備用。各組隨機(jī)選取8只眼球，進(jìn)行HE染色，采用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)觀察視細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)，并測定視網(wǎng)膜外核層厚度，以此作為光感受器細(xì)胞喪失的評判指標(biāo)；并采用TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。凋亡指數(shù)以凋亡細(xì)胞占同一視野細(xì)胞總數(shù)的百分比表示，記數(shù)方法每張玻片測量5個獨(dú)立高倍視野（×400）中陽性細(xì)胞數(shù)。

凋亡指數(shù)（AI）=陽性細(xì)胞核數(shù)/計測細(xì)胞核總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)（S-N-K法），各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 明目 “五子”對光損傷大鼠視網(wǎng)膜mfERG N1波反應(yīng)密度的影響

模型對照組視網(wǎng)膜mfERG各環(huán)N1波反應(yīng)密度均明顯減弱（表1），與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。高劑量組視網(wǎng)膜各環(huán)N1波反應(yīng)密度增強(qiáng)明顯，與模型對照組比較各環(huán)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與正常對照組比較1～4環(huán)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），5 環(huán)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低劑量組與模型組比較，雖數(shù)值有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 明目“五子”對光損傷大鼠視網(wǎng)膜mfERG P1波反應(yīng)密度的影響

模型對照組視網(wǎng)膜mfERG各環(huán)P1波反應(yīng)密度均明顯減弱（表2），與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。高劑量組視網(wǎng)膜各環(huán)P1波反應(yīng)密度增強(qiáng)明顯，與模型對照組比較各環(huán)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與正常對照組比較各環(huán)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低劑量組與模型組比較，雖數(shù)值上有所差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠mfERG N1波反應(yīng)密度的比較（nV/deg2）

表2 各組大鼠mfERG P1波反應(yīng)密度的比較（nV/deg2）

2.3 光鏡下病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常對照組的視網(wǎng)膜形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)層次清楚，TUNEL標(biāo)記只見到極少的凋亡細(xì)胞，內(nèi)外節(jié)排列整齊，二者分界清晰。模型對照組外核層排列欠整齊，較薄，TUNEL標(biāo)記只見到較多的凋亡細(xì)胞。高、低劑量組與模型對照組比較，視網(wǎng)膜外核層略厚，凋亡細(xì)胞較少。各組內(nèi)、外節(jié)分界趨向清楚。

2.4 明目“五子”對大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度的影響

從表1可見，光照后高劑量組視網(wǎng)膜厚度較模型對照組有所增加，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三者與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 光照后各組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度比較（μm）

2.5 明目“五子”對大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡的影響

表4顯示：與模型對照組比較，高劑量組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞凋亡（TUNEL標(biāo)記）陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；三者與正常對照組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞TUNEL標(biāo)記陽性率比較

3 討論

中醫(yī)藥對視網(wǎng)膜疾病的認(rèn)識多從肝腎論述，且古人認(rèn)為：“諸子明目”，多種子仁類藥物都可以用于治療眼部疾患，具有補(bǔ)益肝腎、活血利水等功效。中藥“五子”（枸杞子、菟絲子、五味子、茺蔚子、楮實(shí)子）是中醫(yī)眼科古代若干明目效方中補(bǔ)益肝腎最常用的藥物，臨床實(shí)踐證實(shí)其對視網(wǎng)膜病變有良好的療效，特別是防治視網(wǎng)膜損傷及促進(jìn)損傷后的修復(fù)有著明顯的優(yōu)勢。我們將其作為一個藥組進(jìn)行研究，觀察其對大鼠視網(wǎng)膜光損傷功能的影響。

光化學(xué)損傷是視網(wǎng)膜光損傷中一種重要的損傷機(jī)制，它以不引起明顯溫度升高、低能量、相對較長時間的光照而導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織病理變化為特征。研究表明視網(wǎng)膜的光化學(xué)損傷程度與光波的波長、光照時間、能量、視網(wǎng)膜的暗適應(yīng)狀態(tài)、虹膜色素的多少等有密切的關(guān)系。在一定的波長范圍內(nèi)，視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的敏感性隨著光波波長的縮短而呈對數(shù)關(guān)系上升。為了評估人類日常生活中經(jīng)常接觸的可見光光譜中段的光線對視網(wǎng)膜損傷的情況，本實(shí)驗(yàn)對暗適應(yīng)24小時后未經(jīng)麻醉和散瞳的SD大鼠，采用波長 510～560 nm、平均照度為（1900±106.9）Lux 綠色熒光燈照射，盡可能模擬生活狀態(tài)下造成的光化學(xué)損傷，而使研究更貼近日常視網(wǎng)膜損傷的情況。本課題前期研究表明光照后視網(wǎng)膜色素上皮層、外核層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層均有不同程度的損傷，細(xì)胞排列紊亂，外核層明顯變薄，線粒體腫脹等，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)明目“五子”能夠增加光損傷后大鼠視網(wǎng)膜厚度，減弱視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞凋亡。

多焦視網(wǎng)膜電圖技術(shù)是20世紀(jì)90年代由Sutter等人研制的應(yīng)用m-序列控制偽隨機(jī)刺激方法，同時分別刺激視網(wǎng)膜多個不同部位，用一個常規(guī)電極記錄多個不同部位的混合反應(yīng)信號，再用計算機(jī)作快速Walsh轉(zhuǎn)換，將對應(yīng)于視網(wǎng)膜不同部位的波形分離提取出來，并將視網(wǎng)膜各部位的反應(yīng)密度構(gòu)成立體地形圖，從而定量和直觀地評價視網(wǎng)膜功能〔4-8〕。mfERG可以通過不同的刺激方式引出不同的反應(yīng)。一階反應(yīng)（first-order kernel，F(xiàn)OK）是視網(wǎng)膜對應(yīng)于一個小區(qū)域的并在一個完整m-序列兩種狀態(tài)刺激的兩個平均反應(yīng)之差。對于黑白閃光刺激，在數(shù)值上一階反應(yīng)等于對白光刺激的平均反應(yīng)。

國內(nèi)外學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明mfERG能較好地反應(yīng)視桿細(xì)胞的病變。Ball等〔9〕通過減慢刺激頻率以適應(yīng)大鼠桿細(xì)胞較慢的恢復(fù)時間，成功獲得大鼠mfERG圖形，并對激光光凝術(shù)后的大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行檢測，圖形明確顯示了激光對視網(wǎng)膜的破壞，很好地反應(yīng)了視網(wǎng)膜功能。我們前期實(shí)驗(yàn)亦表明mfERG的一階反應(yīng)能較好的反應(yīng)視網(wǎng)膜功能損傷程度〔2〕。

本實(shí)驗(yàn)中，對大鼠進(jìn)行光照后，mfERG一階反應(yīng)N1及P1波各環(huán)反應(yīng)密度顯著下降。給予一定量的“五子”治療后的大鼠視功能較模型對照組恢復(fù)較好，表明明目“五子”對大鼠視功能有一定的改善作用。

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