楊麗娟，陸海燕，貝麗霞，韓文革，趙長(zhǎng)江，韓德權(quán)

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319；2. 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

副干酪乳桿菌是一種益生菌，其凍干菌粉可直接應(yīng)用于家庭及工廠的蔬菜發(fā)酵中。用副干酪乳桿菌發(fā)酵蔬菜的亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵蔬菜，并且使用方便，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。在家庭以及工廠規(guī)?；a(chǎn)中擁有廣闊的市場(chǎng)前景。而在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中副干酪乳桿菌菌體產(chǎn)量低。采用響應(yīng)面法對(duì)副干酪乳桿菌培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高菌體密度為工業(yè)化生產(chǎn)蔬菜發(fā)酵劑提供必要的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：副干酪乳桿菌（由實(shí)驗(yàn)室分離并保藏）

試劑：葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨均為分析純。

儀器：SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái)，LRH-250 生化培養(yǎng)箱，TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī)，YXQ-SG46-280SA高溫滅菌鍋，752 型紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

碳源篩選：將副干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組分氮源固定為2%酵母膏；碳源分別選擇葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖[1-2]，接種后在37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值并計(jì)算含菌量。

氮源的篩選：將副干酪乳桿菌以5%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組分碳源固定為2%葡萄糖；氮源分別選擇酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨[3-4]，接種后在37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值并計(jì)算含菌量。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

Plackett-Burman 試驗(yàn)：從單因素試驗(yàn)確定的最佳碳源（蔗糖），最佳氮源（酵母膏）以及緩沖鹽中篩選出對(duì)副干酪乳桿菌菌體密度有顯著影響的因素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，接種量5%，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值。

最陡爬坡試驗(yàn)：最陡爬坡法是尋找最優(yōu)區(qū)間的一種方法，可以最大限度接近最佳值，確保響應(yīng)值的準(zhǔn)確性[5]。對(duì)Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出的主要影響因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)產(chǎn)生正效應(yīng)的因子增加用量，產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的因子減少用量。

中心組合試驗(yàn)：對(duì)Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出的對(duì)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）的因素，通過SAS 軟件進(jìn)行分析計(jì)算，預(yù)測(cè)最大響應(yīng)值及與響應(yīng)值相對(duì)應(yīng)的各變量值，并按預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源篩選

副干酪乳桿菌對(duì)不同碳源的代謝能力不同，不同的碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)速度和最終密度都有很大影響。因此，選擇合適的碳源對(duì)菌體增殖培養(yǎng)是十分重要的。研究選取對(duì)乳酸菌增菌培養(yǎng)有較好作用的碳源，蔗糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖，并分別對(duì)其進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳碳源及濃度，其中氮源固定為2%酵母膏。

由圖1 可知，隨著糖濃度的增加菌體密度均有不同程度提高，其中碳源為葡萄糖或蔗糖時(shí)，隨著糖濃度的增加菌體密度提高幅度較大。蔗糖濃度為9%時(shí)菌體密度最大（40×108cfu·mL-1）。因此選擇蔗糖作為副干酪乳桿菌增菌培養(yǎng)基的碳源。

2.1.2 氮源篩選

氮源是副干酪乳桿菌生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，不同的氮源對(duì)菌體密度也有較大影響。因此，選擇合適的氮源對(duì)菌體增殖培養(yǎng)是十分必要的。分別選取對(duì)乳酸菌增菌培養(yǎng)有較好作用的牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳氮源及濃度，其中碳源固定為2%葡萄糖。

圖1 糖濃度對(duì)菌體密度的影響Fig.1 Effect of the Sugar concentration on density

圖2 氮源濃度對(duì)菌體密度的影響Fig.2 Effect of the nitrogen source concentration on density

由圖2 可知，隨著氮源濃度的增加，菌體密度不斷提高，其中以酵母膏增菌效果最為明顯當(dāng)酵母膏濃度2.5%時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值6.05×108cfu·mL-1。酵母膏是常用氮源，價(jià)格低廉，易于被乳酸菌所利用，所以酵母膏較為適于作為副干酪乳桿菌增菌培養(yǎng)基中的氮源。

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選主要影響因素

通過對(duì)幾種碳源、氮源的篩選，可以使菌體找到最佳營(yíng)養(yǎng)條件，從而提高菌體密度。通過Plackett-Burman 試驗(yàn)對(duì)以上單因素試驗(yàn)篩選出的碳源、氮源及對(duì)乳酸增菌培養(yǎng)有輔助作用的無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，選出對(duì)菌體增殖有顯著影響的因素，進(jìn)而確定響應(yīng)面優(yōu)化對(duì)象。隨著培養(yǎng)過程中乳酸的不斷積累，pH值下降，菌體的增殖會(huì)受到限制，因此，在乳酸菌培養(yǎng)基中添加緩沖鹽來緩解pH 值下降，從而使菌體密度達(dá)到最高[6]。選擇對(duì)乳酸菌增殖培養(yǎng)有顯著影響的緩沖鹽：磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、乙酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂及吐溫作為篩選因素，加上單因素試驗(yàn)選出的最佳碳源、氮源共8 個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)，從這8 個(gè)因素中篩選出對(duì)增菌培養(yǎng)有顯著影響的因素[7-8]。

選用N=12 的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)蔗糖、酵母膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、乙酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂及吐溫8 個(gè)因素進(jìn)行研究，每個(gè)因素分別選取-1，+1 兩水平。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1 所示，8 個(gè)因素所代表的參數(shù)水平以及分析結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman design and results

由表2 中的t 檢驗(yàn)可知，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生正效應(yīng)的因素為蔗糖、酵母膏、乙酸鈉和吐溫80，產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的因素為磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳和硫酸鎂。蔗糖和酵母膏在99%的水平上對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，硫酸鎂在95%的水平上對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，其他因素對(duì)響應(yīng)值影響程度較小，所以選取蔗糖、酵母膏和硫酸鎂這3 個(gè)因素作為中心組合試驗(yàn)的研究對(duì)象。其中負(fù)效應(yīng)的因素固定在－1 水平，正效應(yīng)的因素固定在+1 水平。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)分析結(jié)果Table 2 Analysis and results of Plackett-Burman

碳源是乳酸菌生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氮源是乳酸菌中蛋白質(zhì)、核酸的物質(zhì)來源，是乳酸菌生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素[9]。篩選結(jié)果表明，碳、氮源是影響乳酸菌生長(zhǎng)的最重要影響因子。硫酸鎂作為無機(jī)鹽有助于乳酸菌生長(zhǎng)，并對(duì)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸起到緩沖作用，進(jìn)而減緩乳酸過度積累而抑制菌體增殖的現(xiàn)象。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的鄰近領(lǐng)域里才能充分近似真實(shí)情況，在其他區(qū)間里，擬合方程與被近似的函數(shù)方程無相似之處，所以擬合是毫無意義的[10]。因此，必須最大限度的逼近最大菌體密度區(qū)域后才能建立有意義的響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法是以試驗(yàn)值變化梯度方向?yàn)榕榔路较?，以各因素的效?yīng)值大小來確定步長(zhǎng)變化，能夠有效地逼近最大菌體密度區(qū)域。

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)分析的結(jié)果確定下一步試驗(yàn)，即最陡爬坡試驗(yàn)的研究對(duì)象。從表2 中可知，蔗糖、酵母膏有顯著正效應(yīng)，在爬坡試驗(yàn)中用量應(yīng)增加；硫酸鎂有顯著負(fù)效應(yīng)，在爬坡試驗(yàn)中用量應(yīng)減少。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，從表3 中可以清楚地看出，4 號(hào)試驗(yàn)蔗糖、酵母膏、硫酸鎂質(zhì)量濃度分別為9.6%、2.65%、0.027%時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值，然后隨著質(zhì)量濃度的變化菌體密度不斷降低。4 號(hào)試驗(yàn)的質(zhì)量濃度接近最大響應(yīng)區(qū)域，所以研究利用該質(zhì)量濃度作為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)及結(jié)果Table 3 The results of steepest climbing test

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)可知，響應(yīng)變量Y 值逼近菌體密度最大值，以4 號(hào)試驗(yàn)條件作為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果如表4和表5 所示。

表4 中心組合試驗(yàn)中變量及其水平Table 4 Factors level of the central composite response test

以菌體密度Y1為因變量，因素X1，X2，X7為自變量的回歸方程為：

利用F 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)方程，得到概率水平在99%的條件下回歸是顯著的（P<0.000 1）。方程的確定系數(shù)R2=94.69%，這說明94.69%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用這個(gè)方程解釋。圖3、圖4 和圖5 顯示方程的三維響應(yīng)面，證實(shí)了擬合面有真實(shí)的最大值。

通過軟件計(jì)算得到，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為9.50%，酵母膏質(zhì)量濃度為2.73%，硫酸鎂質(zhì)量濃度為0.027%時(shí)，菌體密度達(dá)到了最大值5.18×109。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，在這個(gè)點(diǎn)進(jìn)行了3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到菌體密度的平均值為5.16×109，與數(shù)學(xué)模型得到的最大菌體密度數(shù)據(jù)有較好的吻合，這說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的較好。

表5 中心組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of central composite response test

圖3 蔗糖與酵母膏交互作用對(duì)菌體密度影響的響應(yīng)面圖（A）和等高線（B）Fig.3 The peak response area and contour line images describing the effect of the interactions between Sucrose and Yeast extract on density

圖4 蔗糖與硫酸鎂交互作用對(duì)菌體密度影響的響應(yīng)面圖（A）和等高線（B）Fig.4 The peak response area and contour line images describing the effect of the interactions between Sucrose and Dipotassium hydrogen phosphate on density

圖5 酵母膏與硫酸鎂交互作用對(duì)菌體密度影響的響應(yīng)面圖（A）和等高線（B）Fig.5 The peak response area and contour line images describing the effect of the interactions between Yeast extract and Dipotassium hydrogen phosphate on density

3 結(jié)果與討論

副干酪乳桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化過程中，首先通過單因素試驗(yàn)確定最佳碳源、氮源，然后通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)研究了培養(yǎng)基各組分對(duì)菌體密度的影響程度，找出了影響顯著的3 個(gè)因素蔗糖，酵母膏，硫酸鎂。然后通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域。最后設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，擬合出一個(gè)三元二次多項(xiàng)式方程，找出了最佳值。最佳配方為蔗糖9.50%、酵母膏2.73%、硫酸鎂0.027%、檸檬酸鈉0.3%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.15%、硫酸錳0.01%、吐溫0.05%，得到最大菌體密度5.16×109。實(shí)驗(yàn)中的碳源采用了蔗糖，增菌效果優(yōu)于張建友等人[11]的菌體密度優(yōu)化結(jié)果108，不僅大幅度提高了菌體密度，而且由于蔗糖價(jià)格低廉，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。酵母膏是一種較易于乳酸菌利用的氮源，是乳酸菌中蛋白質(zhì)、核酸的物質(zhì)來源，是乳酸菌生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素[12]。硫酸鎂作為無機(jī)鹽有助于乳酸菌生長(zhǎng)，并對(duì)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸起到緩沖作用，進(jìn)而減緩乳酸過度積累而抑制菌體增殖的現(xiàn)象。

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