張亞敏，陳素輝，孫 華△，徐 虹，包 飛，王道海，高 揚

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005)

缺血性腦血管病屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇。多年來，針刺治療腦血管病取得了良好療效。研究顯示電針能促進腦缺血大鼠缺血區(qū)血管再生，增加腦血流量，減輕缺血區(qū)細(xì)胞凋亡[1－2];且能調(diào)節(jié)腦缺血再灌注區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)及細(xì)胞間黏分子－1(ICAM－1)等炎癥損傷相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕缺血再灌注后的腦水腫和腦組織損傷[]。外周血是機體宏觀調(diào)節(jié)信號的有效載體，通過檢測外周血中相關(guān)信號的變化可以反映腦組織局部的炎癥損傷程度及機體對局部損傷和損傷修復(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化。研究表明針刺百會和足三里穴能夠影響腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清蛋白的表達(dá)，干預(yù)其生理病理過程[4]。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測大鼠外周血清中白細(xì)胞介素1β(IL－1β)、白細(xì)胞介素6(IL－6)的表達(dá)，探討針刺百會和足三里穴在腦缺血再灌注損傷炎癥調(diào)節(jié)機制中的可能作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重260～310 g，10～12周齡，中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供[實驗動物證書:SCXK(京)2009－0017]。飼養(yǎng)條件:每籠5 只，光照:黑暗 =12 h∶12 h，室溫(25 ±3)℃，濕度75%，自由進食和飲水。實驗動物操作參照實驗動物研究指南。

1.2 主要試劑和器材設(shè)備

2636－4A、2634－4A線栓(北京沙東生物技術(shù)公司);長城牌KWD－808Ⅱ全能脈沖電療儀(常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司);漢醫(yī)牌一次性無菌針灸針(天津華鴻醫(yī)材有限公司);全自動多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);雙抗體夾心IL－1β ELISA試劑盒，雙抗體夾心IL－6 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);漩渦混合器(北京北德科學(xué)器材有限公司)。

1.3 模型制備和神經(jīng)功能評分

模型制備參考Longa等[5]的線栓法。線栓插入2 h后拔出以實現(xiàn)再灌注，待大鼠蘇醒對其行神經(jīng)功能評分，判斷造模是否成功。神經(jīng)功能評分依據(jù)Bederson等[6]的5級分類法:0級:神經(jīng)功能無缺損;1級:左前肢不能完全伸展;2級:左前肢屈曲，向左側(cè)推動時阻力下降;3級:爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4級:意識不清，包括24 h內(nèi)死亡。將0級和4級剔除實驗。

1.4 實驗分組與處理

將實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和針刺組3個大組，每大組按照缺血再灌注后時間分成12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和144 h共6 個亞組，每亞組8 只大鼠;另外設(shè)正常對照組8只。假手術(shù)組模擬手術(shù)損傷，分離至頸內(nèi)、外動脈，不插入線栓，縫合，不治療;模型組造模成功后不治療;針刺組造模成功后，定位百會和足三里穴[7]，消毒后進針，針柄連接脈沖電療儀，疏密波，強度 2 mA，頻率 2～100 Hz，日 1次，每次20 min;正常對照組作為空白對照，不施手術(shù)，不治療。

1.5 IL －1β、IL －6 測定

各組大鼠按規(guī)定時間點用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，室溫靜置 2 h，離心(3 500 rpm，20 min)，分離血清，分裝血清，存放于－80℃冰箱中備用。取備用血清用ELISA法測IL－1β、IL－6值，具體操作嚴(yán)格遵循試劑盒說明。

1.6 ELISA數(shù)據(jù)讀取與分析

在酶標(biāo)儀450 nm處測OD 值，對標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及其相應(yīng)的已知濃度，做相關(guān)分析。然后以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出R2(相關(guān)系數(shù))值和求解樣品濃度的公式，計算樣品濃度。本數(shù)據(jù)為計量資料，滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析(one－way ANOVA)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較應(yīng)用LSD－t檢驗，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血清IL－1β表達(dá)的變化

IL－1β在模型組呈雙峰形表達(dá)，峰值時間分別為24 h和96 h。IL－1β在針刺組表達(dá)強度低于模型組，以24 h組和96 h組最顯著(P＜0.05);IL－1β在假手術(shù)組表達(dá)低于模型組，其中96 h組差異具有顯著性(P＜0.05)。見表1及圖1。

表1 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－1β濃度值(±s)

表1 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－1β濃度值(±s)

注:與模型組比較，☆P ＜0.05;與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與正常組比較，*P ＜0.05。

12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h針刺組 8 81.88 ±16.9* 60.50 ±18.01☆△＊ 95.78 ±30.21 72.01 ±24.40* 96.21 ±37.29☆ 90.05 ±36.87組別 n*模型組 8 75.76 ±13.6* 118.02 ±45.24 88.98 ±54.23* 84.85 ±49.61* 157.23 ±19.36△ 67.51 ±4.32*假手術(shù)組 8 83.56 ±20.00*105.45 ±43.83 95.83 ±31.15 94.16 ±11.85 63.81 ±22.00* 86.47 ±22.69*正常組 8 123.05 ±58.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64

表2 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－6濃度值(±s)

表2 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－6濃度值(±s)

注:與模型組比較，☆P ＜0.05;與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與正常組比較，*P ＜0.05。

12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h針刺組 8 39.02 ±4.54* 37.32 ±7.52△ 34.86 ±4.69☆△ 53.48 ±33.06* 41.23 ±6.83* 42.96 ±3.72組別 n*模型組 8 38.38 ±3.63* 40.87 ±5.55＊△ 39.77 ±3.55* 42.90 ±8.65 40.91 ±6.87* 43.29 ±11.46*假手術(shù)組 8 39.07 ±5.33* 49.83 ±3.40* 42.86 ±9.44* 52.66 ±14.39* 42.32 ±6.23* 43.92 ±5.04*正常組 8 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81

圖1 不同時間點各組大鼠外周血清IL－1β表達(dá)的變化

圖2 不同時間點各組大鼠外周血清IL－6表達(dá)的變化

2.2 各組大鼠外周血清IL－6表達(dá)的變化

IL－6在模型組的表達(dá)高于正常組(P＜0.05);IL－6在針刺組各時間點的表達(dá)低于模型組和假手術(shù)組，其中24 h和48 h組具有顯著性差異(P＜0.05)。IL－6在假手術(shù)組中呈雙峰形表達(dá)，峰值時間在24 h和72 h，假手術(shù)組各個時間點IL－6的表達(dá)高于模型組，但除24 h組外，其余時間點無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2及圖2。

3 討論

缺血性腦卒中主要病機為臟腑陰陽失調(diào)，導(dǎo)致機體氣血逆亂，上犯腦竅，腦絡(luò)瘀阻而發(fā)病。根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論，腦缺血后機體正氣不足，屬于積損正衰。百會穴屬督脈，位于巔頂，“頭者神之居”為“精明之府”，且督脈總督一身之陽，具有開竅醒神之功。足三里穴為足陽明胃經(jīng)的合穴，陽明經(jīng)多氣多血，臨床選穴有“治痿獨取陽明”原則。兩穴合用可疏經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪以調(diào)節(jié)機體陰陽平衡。根據(jù)導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗和實驗總結(jié)，發(fā)現(xiàn)針刺百會和足三里穴在治療神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病等方面優(yōu)勢顯著。

IL－1β在正常腦組織中低表達(dá)，腦缺血再灌注損傷后，由局部浸潤的單核－巨噬細(xì)胞、活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等分泌，可促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖并表達(dá)粘附分子，募集白細(xì)胞，刺激單核－巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF －a、IL－6等細(xì)胞因子，加重局部炎癥反應(yīng)[8]。還可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平破壞血腦屏障[9]，進而使中樞腦組織的炎癥反應(yīng)信號通過血液傳遞至外周，活化外周免疫系統(tǒng)中的炎性細(xì)胞;同時可募集外周炎性細(xì)胞至中樞損傷腦區(qū)，參與中樞損傷及損傷修復(fù)過程。腦缺血再灌注后24 h，外周血炎性細(xì)胞因子(如IL－1β、IL－6)大量表達(dá)于粘附分子和趨化因子等可募集炎癥細(xì)胞，移行至缺血損傷區(qū)，進一步破壞血腦屏障，加重局部神經(jīng)元壞死，擴大炎癥反應(yīng)[10]。

IL－6在腦缺血急性期是重要的炎癥介質(zhì)，可導(dǎo)致腦炎性損傷，但在腦缺血亞急性期IL－6通過連同白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)等發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11]。且外周血中的IL－6水平是反應(yīng)腦缺血損傷早期的靈敏性指標(biāo)，研究[12]顯示，MCAO模型中IL－6在外周血2 h即開始上升，早于腦組織開始上升時間(24 h)。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠外周血清中的IL－1β在缺血再灌注24 h后出現(xiàn)第1個峰值，該峰值信號一般反映炎癥的損傷程度，96 h達(dá)到第2個峰值，由于中后期峰值的表達(dá)通常由早期的損傷信號和中后期的損傷修復(fù)信號疊加形成，故后者強度高于前者。本實驗中，假手術(shù)組大鼠外周血清的IL－6表達(dá)高于模型組，國外研究[]中亦發(fā)現(xiàn)有相似結(jié)果。腦缺血再灌注模型是一種高強度的病理性應(yīng)激反應(yīng)，損傷應(yīng)激程度高于假手術(shù)組，考慮是模型組釋放的兒茶酚胺類和糖皮質(zhì)激素等應(yīng)激激素較假手術(shù)組多，而這些激素可抑制免疫系統(tǒng)的應(yīng)答活化，減少免疫細(xì)胞因子的表達(dá)，故模型組的IL－6表達(dá)水平低于假手術(shù)組。實驗中正常組大鼠外周血清IL－1β表達(dá)較模型組高，尚未找到有關(guān)證據(jù)支持，考慮外周血影響因素較多，這種情況可能由于實驗誤差導(dǎo)致，有待進一步探討。

本研究觀察到，腦缺血再灌注早期，針刺組大鼠外周血清炎性細(xì)胞因子IL－1β、IL－6的表達(dá)低于未經(jīng)干預(yù)的腦缺血模型組;腦缺血中后期，隨著炎癥損傷反應(yīng)的抑制，針刺組大鼠外周血清中的IL－1β表達(dá)強度低于模型組，而IL－6表達(dá)上升，提示針刺百會、足三里穴在腦缺血損傷早期可能通過下調(diào)外周血清IL－1β、IL－6的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，腦缺血損傷中后期可能通過上調(diào)IL－6的表達(dá)促進腦組織的損傷修復(fù)，發(fā)揮腦保護作用。

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