任鳳云 宋秋穎 張增雷 劉 星 (牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157110)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達(dá)增高與2型糖尿病腎病(2-DN)密切相關(guān)，因此，通過阻斷和下調(diào)TGF-β1表達(dá)可能有助于延緩2-DN的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)探討銀杏達(dá)莫注射液對2-DN的緩沖作用和對腎臟TGF-β1表達(dá)的影響，探討其對2-DN大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 銀杏達(dá)莫注射液夠于貴州益佰制藥股份有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司產(chǎn)品;TGF-β1免疫組化試劑盒購于美國R＆D公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)選取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重180～200 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。隨機(jī)取15只作為正常組(A組)，另外45只為模型組(B組)給以高脂飲食，持續(xù)喂養(yǎng)8 w后，腹腔一次性注射STZ注射劑15 mg/kg，隨機(jī)宰殺大鼠，檢測腎組織病理及各項(xiàng)指標(biāo)。A組15只給以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，8 w后注射相同體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。B組大鼠注射STZ 12 w之后，大鼠出現(xiàn)典型的2-DN特點(diǎn)。將造膜成功的DN大鼠隨機(jī)選取30只分成B組和C組各15只，治療組以0.5 ml/kg銀杏達(dá)莫注射液腹腔注射對大鼠進(jìn)行治療，B組繼續(xù)給予高脂飲食，8 w 后處死大鼠〔1〕。

1.3 普通標(biāo)本 注意大鼠一般情況及行為改變。定時稱重并留取血尿標(biāo)本。

1.4 腎組織病理標(biāo)本 乙醚麻醉，斷頭處死大鼠，取腹正中切口，暴露并切取雙腎，左腎用甲醛固定，石蠟包埋組織切片;右腎迅速置于液氮中封存。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢查 造模前、造模成功和實(shí)驗(yàn)結(jié)束前分別測各組動物空腹血糖(FPG)、葡萄糖耐量(OGTT)、Scr、BUN、Upr等指標(biāo)。腎組織行HE染色，光鏡下觀察腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)及間質(zhì)改變。Real time RT-PCR法檢測 TGF-β1 mRNA表達(dá)。ELISA法檢測血清中TGF-β1分泌水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0完成，計量資料以s表示，組間比較用方差分析(t檢驗(yàn))，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，兩組間的關(guān)系比較采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況改變 成模大鼠體毛雜亂且反應(yīng)遲緩，明顯的多尿、多食、體重減輕。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠OGTT變化 B組大鼠糖耐量出現(xiàn)明顯異常，與A組比較有顯著差異(P＜0.01)，1 h血糖達(dá)最高，2 h血糖仍高;A組大鼠30 min血糖達(dá)到最高，2 h基本恢復(fù)正常。見表1。

2.3 銀杏達(dá)莫注射液對2-DN大鼠BUN、Scr、24 h尿蛋白影響與A組相比，B組及C組大鼠BUN、SCr、24 h UPr顯著升高(P＜0.01);與 B組相比，C 組 BUN、Scr、24 hUPr顯著降低(P＜0.01)。見表2。

2.4 HE染色顯微鏡觀察腎組織結(jié)構(gòu) A組:腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列整齊，腎小球、腎小管及間質(zhì)未見病理改變。B組:腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小球細(xì)胞數(shù)量減少，毛細(xì)血管腔塌陷，部分腎小球萎縮，腎小管上皮灶性細(xì)胞腫脹、自溶、壞死。C組:多數(shù)腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。部分腎小球系膜基質(zhì)增生，周圍腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹、自溶，但無明顯壞死。見圖1。

2.5 銀杏達(dá)莫注射液對2-DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 B組的TGF-β1 mRNA表達(dá)量最高(1.54±0.492)，A組為0.55±1.21;經(jīng)銀杏達(dá)莫注射液治療后TGF-β1 mRNA表達(dá)量明顯下降(0.92±0.082，P＜0.05)。

2.6 銀杏達(dá)莫注射液對血清中TGF-β1分泌的影響 TGF-β1含量明顯高于A組〔(3 272.41±268.38)pg/ml vs(764.90±204.33)pg/ml，P ＜0.01〕，C 組 TGF-β1 含量較 B 組明顯降低〔(1 728.94 ±384.68)pg/ml，P ＜0.05〕。

表1 正常大鼠與模型大鼠糖耐量的變化(s)

表1 正常大鼠與模型大鼠糖耐量的變化(s)

與A組比較:1)P＜0.01

別 n0 h 0.5 h 1 h 2 h組B組 40 15.51±2.05 19.58±2.09 25.17±3.101)20.55±2.561)A組15 5.34±1.43 10.42±1.45 7.53±1.24 5.82±0.90

表2 銀杏達(dá)莫注射液對大鼠BUN、Scr、UPr的影響( s，n=15)

表2 銀杏達(dá)莫注射液對大鼠BUN、Scr、UPr的影響( s，n=15)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

組別 BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)UPr(mg/24 h)A組6.49±0.64 53.30±3.55 9.16±1.34 B組 21.88±3.111) 120.27±5.881) 26.88±4.771)C組 13.44±2.491)2) 79.32±3.121)2) 18.20±1.951)2)

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變

3 討論

在DM發(fā)生前胰島素抵抗往往已經(jīng)存在。本模型采用健康大鼠高熱量飲食一段時間，使之產(chǎn)生胰島素抵抗。因機(jī)體胰島代償能力強(qiáng)，單純嚴(yán)重的胰島素抵抗不足以引起DM。小劑量STZ破壞胰島程度輕，單純作用不影響基礎(chǔ)胰島素的分泌，它與高熱量飲食兩者獨(dú)立干預(yù)均不能造成DM，只有兩者結(jié)合可能使大鼠發(fā)生高血糖。大鼠對STZ的敏感性具有年齡依賴性，成鼠及大體重鼠較幼鼠或小體重鼠更易成模。STZ的劑量決定了同一種系中STZ致β細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度，小劑量STZ誘導(dǎo)鼠類β細(xì)胞系INS 1凋亡，高劑量則導(dǎo)致壞死。STZ劑量越小對對其他組織造成的損害越小。

TGF-β1是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的重要作用因子之一〔2，3〕。作為一種重要的致纖維化因子，TGF-β1參與 ECM成分的進(jìn)行性積聚過程，如刺激ECM中纖維連接蛋白、膠原等合成，減少蛋白酶表達(dá)和增加蛋白酶抑制合成，上調(diào)ECM受體整合素的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞與間質(zhì)黏附和基質(zhì)沉積等〔4，5〕，抗TGF-β1治療能夠善DN大鼠腎臟的損傷情況，減少ECM的聚集〔6〕。本實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1基因表達(dá)水平與DN間質(zhì)損害程度密切相關(guān)。2-DN大鼠早期腎臟TGF-β1基因的表達(dá)顯著增加，尿TGF-β1表達(dá)水平與尿白蛋白及尿肌酐顯著相關(guān)，而與體重及血糖改變無相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)性大鼠TGF-β1蛋白表達(dá)增加可能參與2-DN的早期發(fā)病機(jī)制，腎小球?yàn)V過功能增加，尿蛋白排泄增加，TGF-β1基因表達(dá)水平高低一定程度上反映腎小球硬化和間質(zhì)損害的嚴(yán)重程度。

2-DN最初表現(xiàn)為蛋白尿，繼而出現(xiàn)腎功能下降，血肌酐和尿素氮升高，2-DN的主要臨床表現(xiàn)為有水腫、高血壓以至低蛋白血癥，其輕重主要與腎臟損害程度有關(guān)。DN中，肉眼所見受累腎臟不論是病變早期還是病變晚期，其體積均傾向增大。在組織學(xué)改變中，腎小球病變大體反映了DN的特征，其最初受累部位在系膜，基本病變是基底膜物質(zhì)增多，并侵占系膜細(xì)胞，同時伴有毛細(xì)血管基底膜增厚。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀杏達(dá)莫注射液可以有效地保護(hù)和治療2-DN腎臟的損傷。

1 任鳳云，郭麗雙，馮 華，等.銀杏達(dá)莫注射液對實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠腎臟TGF-1表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(22):4604-6.

2 Wu Y，Ren K，Liang C，et al.Renoprotective effect of total glucosides of paeony(TGP)and its mechanism in experimental diabetes〔J〕.J Pharmacol Sci，2009;109(1):78-87.

3 孫培榮，石永兵，施曉松.銀杏達(dá)莫對梗阻性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化中TGF-β1表達(dá)的影響［J］.中國誤診學(xué)雜志，2010;26(9):6304-6.

4 Dixon A，Maric C.17β-estradiol attenuates diabetic kidney disease by regulating extracellular matrix and transforming growth factor-βprotein expression and signaling〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2007;293(5):1678-90.

5 Van Huyen JP，Viltard M，Nehiri T，et al.Expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 is altered during nephrogenesis in fetuses from diabetic rats〔J〕.Lab Invest，2007;87(7):680-9.

6 Wang W，Huang XR，Canlas E，et al.Essential role of Smad3 in angiotensin Ⅱ-induced vascular fibrosis〔J〕.Circ Res，2009;98(8):1032-9.