王 鵬 李 樂 蘇哲君 霍 峰 王笑茹 李春輝 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，河北 承德 067000)

目前有關(guān) β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、環(huán)氧化酶-2(Cox-2)在腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的研究日益受到人們的關(guān)注〔1，2〕。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法檢測舌癌組織及正?？谇火つぶ笑?catenin、Cox-2的表達(dá)情況，探討兩者在舌癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科2006～2011年手術(shù)切除及活檢后經(jīng)病理診斷明確的存檔舌癌標(biāo)本60例，男37例，女23例，年齡40～75歲，平均55.3歲。所有患者手術(shù)前均未經(jīng)放療、化療或免疫治療;所有舌癌病例均經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科資深醫(yī)師組織病理學(xué)證實，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2002年《頭頸部腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)》，病理分型為高分化19例，中分化26例，低分化15例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例。收集舌外傷、舌修整正常舌黏膜組織30例作為正常對照。

1.2 標(biāo)本處理 檢測標(biāo)本置40 g/L的中性甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.3 主要試劑及儀器 Cox-2(美國Santa Cruz)、β-catenin鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz);SP染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.4 方法 S-P法免疫組化染色:采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS液處理，分步滴加一抗、生物素標(biāo)記二抗及過氧化物酶溶液進(jìn)行孵育，DAB顯色;復(fù)染，逐級脫水，透明，封片。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) β-catenin免疫組化陽性信號為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒，染色判斷標(biāo)準(zhǔn)按照文獻(xiàn)〔3〕研究方法。細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失及異位表達(dá)統(tǒng)稱為異常表達(dá)。Cox-2表達(dá)結(jié)果判定:細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜或細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色(細(xì)顆粒)為Cox-2陽性細(xì)胞。在高倍鏡下(×100)隨機(jī)選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算平均百分率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時采用Fisher精確概率檢驗法;相關(guān)分析使用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin和Cox-2在正常舌黏膜及舌癌中的表達(dá) 見圖1。β-catenin在正常舌黏膜中全部明顯表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜，僅少數(shù)胞質(zhì)弱表達(dá)，未見核表達(dá)。正常口腔黏膜組織中Cox-2均為陰性表達(dá)。在舌組織中，β-catenin異常表達(dá)率為72%，主要為細(xì)胞膜表達(dá)減弱，向胞質(zhì)或胞核轉(zhuǎn)位，出現(xiàn)異常表達(dá)，或胞膜胞核都不表達(dá)，而且大多數(shù)伴有不同程度細(xì)胞膜表達(dá)缺失。Cox-2在舌癌組織中陽性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，為棕色顆粒，陽性表達(dá)率80%。

2.2 β-catenin和Cox-2表達(dá)與舌癌臨床病理特征的關(guān)系 見表1。β-catenin和Cox-2表達(dá)與年齡、性別無關(guān)，β-catenin異常表達(dá)與腫瘤TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.01)，Cox-2陽性表達(dá)與組織分化程度、腫瘤TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.01)。

圖1 β-catenin、Cox-2蛋白的表達(dá)(DAB，×100)

2.3 β-catenin和Cox-2在舌癌中表達(dá)的相關(guān)性 β-catenin與Cox-2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.867，P＜0.001)。

表1 β-catenin和Cox-2表達(dá)與舌癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討論

β-catenin是一種由連環(huán)蛋白基因編碼的多功能蛋白質(zhì)。正常情況下，β-catenin僅表達(dá)于細(xì)胞膜，少量表達(dá)于胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)，在胞核內(nèi)無表達(dá)。具有參與細(xì)胞黏附與Wnt通路信號傳導(dǎo)雙重功能，對于維持上皮細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)完整和抑制腫瘤的侵襲及新陳代謝過程起著重要的作用〔3〕。腫瘤細(xì)胞中的Wnt信號通路異常可促使腫瘤的發(fā)生。Wnt通路活化后，胞質(zhì)中游離β-catenin蛋白增多，使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合，形β-catenin-TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，激活下游相關(guān)基因 c-myc、Cox-2、cyclinD1等，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔4〕。多項研究〔5～7〕表明，β-catenin 在細(xì)胞膜表達(dá)減少可使細(xì)胞失去黏附功能導(dǎo)致細(xì)胞分散，癌細(xì)胞表型改變獲得高侵襲性，易于發(fā)生浸潤與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，β-catenin可能在舌癌的細(xì)胞黏附和腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用。

在許多促炎和致突變因素的刺激下，Cox-2可被誘導(dǎo)出來，參與病理過程。有研究表明，Cox-2對于淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移可以提供有益條件，Cox-2還直接改變腫瘤細(xì)胞表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤侵襲的機(jī)制。Cox-2可以通過PGE2來參與調(diào)控腫瘤的生長與分化，PGE2通過G蛋白耦聯(lián)途徑等來促進(jìn)細(xì)胞的生長，Cox-2也可能通過誘導(dǎo)Bcl-2等的表達(dá)從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。郭貴龍等〔8〕研究表明Cox-2參與并促進(jìn)了腫瘤新生血管的發(fā)生發(fā)展。O'Connor等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)Cox-2的水平與預(yù)后有密切關(guān)系，Cox-2水平較高的預(yù)后較差。本實驗發(fā)現(xiàn)，Cox-2在舌癌中陽性表達(dá)率為80%，并與組織分化程度、TNM分期和有否無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但在正常組織中未見表達(dá)。舌癌組織中Cox-2高表達(dá)，可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、增強(qiáng)腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)生成從而促進(jìn)腫瘤血管的形成有關(guān)〔10〕。結(jié)果提示，Cox-2可能是一個判斷舌癌進(jìn)展的惡性程度有價值的指標(biāo)。

舌癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因、分子水平的異常，舌體組織癌變是由多個因素參與及共同作用的結(jié)果。本研究提示βcatenin、Cox-2蛋白在舌癌的發(fā)生發(fā)展過程中相互影響，它們之間可能存在特殊的調(diào)控關(guān)系，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

1 Kim I，Kwak H，Lee HK，et al.β-Catenin recognizes a specific RNA motif in the cyclooxygenase-2 mRNA 3'-UTR and interacts with HuR in colon cancer cells〔J〕.Nucl Acids Res，2012;40(14):6863-72.

2 Chiang SL，Chen PH，Lee CH，et al.Up-regulation of inflammatory signalings by areca nut extract and role of cyclooxygenase-2 a polymorphism reveal risk of oral cancer〔J〕.Cancer Res，2008;68(20):8489-98.

3 Gao S，Eiberg H，Krogdahl A，et al.Cytoplasmic expression of E-cadherin and beta-catenin correlated with LOH and hypermethylation of the APC gene in oral squamous cell carcinomas〔J〕.Oral Pathol Med，2005;34(2):116.

4 Lim K，Han C，Dai Y，et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acids inhibit hepatocellular carcinoma cell growth through blocking β-catenin and cyclooxygenase-2〔J〕.Mol Cancer Ther，2009;8(11):3046-55.

5 Moon RT，Kohn AD，de Ferrari GV，et al.Wnt and beta-catenin signaling:diseases and therapies〔J〕.Nat Rev Genet，2004;5(9):691.

6 Takahashi M，Tsurtoda T，Sdki M，et al.Identification of membrane-type matrixmetalloproteinase-1 as a target of the beta-catenin/Tef4 complex in human colorectal cancers〔J〕.Oncogene，2002;21(38):5861.

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8 郭貴龍，姚榛祥.環(huán)氧化酶-2在人乳腺癌中的表達(dá)及對腫瘤血管形成的影響〔J〕.中華外科雜志，2004;42(20):1271-2.

9 O'Connor JK，Avent J，Lee RJ，et al.Cyclooxygenase-2 expression correlates with diminished survival in invasive breast cancer treated with mastectomy and radiotherapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006;58(4):1034-40.

10 王維麗，張英懷，張杰英，等.口腔鱗狀細(xì)胞癌中COX-2、VEGF和EGFR的表達(dá)及意義〔J〕.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)，2006;20(3):277-80.