陳文珠 陳 豆(廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 5020)

洛伐他汀能顯著降低血漿中膽固醇和低密度脂蛋白水平，具有良好的降血脂作用〔1〕，且不存在膽固醇類物質(zhì)蓄積，在治療劑量下不會(huì)影響細(xì)胞膜正常功能所需要的膽固醇量，不良反應(yīng)較小。目前其上市劑型有普通片劑和膠囊劑，但半衰期較短(t1/2=3 h)。本文研究其在大鼠小腸不同部位的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 儀器 Dionex高效液相色譜儀、電子分析天平(日本島津公司);XW-80A微型渦旋混合儀(上海市滬西分析儀器廠有限公司);TG16B高速離心機(jī)(湖南長沙凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);BT00-100 M蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。洛伐他汀對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào):100600-200301，純度:99.5%);甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，色譜純);水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠，2個(gè)月齡，體質(zhì)量(220±20)g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證:SKXK(粵)2010-0010。

1.3 對(duì)照品溶液 精密稱取洛伐他汀對(duì)照品5.0 mg，置于5 ml量瓶中，以甲醇溶解定容，得1.0 mg/ml的對(duì)照品溶液。

1.4 灌流供試液 精密稱取洛伐他汀對(duì)照品適量，置于50 ml量瓶中，以Krebs-Ringer緩沖液(K-R 液)〔2〕溶解定容，即得灌流供試液。

1.5 單向腸灌流試驗(yàn)〔3〕取禁食12 h的SD大鼠，自由飲水，腹腔注射25%烏拉坦(40 mg/kg)麻醉，沿腹中線打開腹腔，分離待考察腸段(十二指腸、空腸、回腸)，取約10 cm于兩端切口，插入硅膠管后結(jié)扎。用生理鹽水(37℃)沖洗腸道，用空白K-R液灌流，取0.25～2.0 h的灌流液，得空白灌流液。另取灌流供試液(37℃)灌流腸道，以0.2 ml/min的流速平衡45 min，進(jìn)口處用已知質(zhì)量的裝有灌流供試液的小瓶灌流，出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集，每隔15 min迅速更換下一個(gè)灌流供試液小瓶和接收液小瓶，稱質(zhì)量，計(jì)算灌入和收集的灌流液質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)持續(xù)105 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剪下被考察腸段，測(cè)量長度(l)和內(nèi)半徑(r)。腸段區(qū)間:十二指腸段為自幽門下1 cm處開始，空腸段為自幽門15 cm處開始，回腸段為自盲腸上行20 cm處開始。

1.6 灌流液體積的校正 采用質(zhì)量法校正因腸內(nèi)水分吸收引起灌流液體積的變化。精密量取灌流供試液1.0 ml，置于已稱重的干凈玻璃瓶中，稱量，計(jì)算其密度ρin。從收集的灌流液樣品中各精密量取1.0 ml，置于已稱重的干凈玻璃瓶中，稱量，計(jì)算其密度ρout。min和mout分別為灌入和收集的灌流液質(zhì)量，則Vin=min/ρin;Vout=mout/ρout。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用質(zhì)量法計(jì)算洛伐他汀的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀速率常數(shù)(Papp)。

式中，V為灌流腸段的體積(ml)，cin和cout分別為腸道灌入和收集的灌流液的質(zhì)量濃度(mg/L)，Vin和Vout分別為灌入和收集的灌流液的體積(ml);Qin為灌流速度(ml/min)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:Kromasil KR 100-5 C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇、水(75∶25)，流速1 mg/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長:236 mm;進(jìn)樣量:20 μm。取空白灌流液、洛伐他汀對(duì)照品溶液和空腸吸收樣品各1.5 ml，于離心機(jī)中15 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液20 μl進(jìn)樣，測(cè)定。結(jié)果表明，在該色譜條件下，空白灌流液對(duì)洛伐他汀的測(cè)定無干擾。見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取洛伐他汀對(duì)照品溶液0.5 ml，置于5 ml量瓶中，加入甲醇定容，得100.0 mg/L的溶液。分別移取該溶液適量于2 ml量瓶中，以甲醇定容，得0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各進(jìn)樣 20 μl，測(cè)定。以洛伐他汀的峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.108 6X－0.238 7(r=0.999 1)。結(jié)果表明，洛伐他汀檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.25～25.0 mg/L。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 精密度試驗(yàn) 取5.0、10.0、25.0 mg/L的洛伐他汀對(duì)照品溶液，于1 d內(nèi)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)RSD;每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，日內(nèi)RSD為1.24%，日間RSD為2.09%。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 用空白灌流液制備含洛伐他汀5.0、10.0、25.0 mg/L的樣品溶液，置于37℃恒溫水浴中孵育，分別于0、0.5、1、2、3 h取樣，考察洛伐他汀的穩(wěn)定性。結(jié)果，洛伐他汀在3 h內(nèi)的RSD均＜2.5%，表明其在空白灌流液中穩(wěn)定較好。

2.5 影響藥物腸吸收的因素

2.5.1 藥物質(zhì)量濃度對(duì)腸吸收的影響 用K-R液制備含洛伐他汀5.0、10.0、25.0 mg/L的供試液，以空腸為灌流部位，進(jìn)行大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)4次，計(jì)算Ka和Papp，考察灌流液質(zhì)量濃度對(duì)洛伐他汀腸吸收的影響。結(jié)果，5.0、10.0、25.0 mg/L的供試液的 Ka分別為(0.132±0.009)、(0.145 ± 0.013)、(0.047 ±0.007)/min，Papp分別為(0.017 ±0.004)、(0.026 ± 0.006)、(0.005 ±0.001)cm/min，且組間比較有顯著性差異(P﹤0.05)，有高濃度飽和現(xiàn)象，表明藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)可能有載體的參與。

2.5.2 吸收部位對(duì)腸吸收的影響 取待考察的十二指腸、空腸和回腸各10 cm，以“2.5.1”項(xiàng)下10.0 mg/L的供試液，進(jìn)行大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)，重復(fù)4次，計(jì)算各腸段的Ka和Papp。十二指腸、空腸和回腸的Ka分別為(0.141±0.005)、(0.144±0.011)、(0.145±0.003)/min，Papp分別為(0.025±0.005)、(0.026±0.003)、(0.026±0.002)cm/min，各腸段間比較無明顯差異(P﹥0.05)，表明洛伐他汀在小腸各段的吸收較好，無特定吸收部位。

3 討論

研究藥物腸吸收的方法有離體法、在體法、體內(nèi)法等〔4〕，其中在體法應(yīng)用更為廣泛。在體法主要包括在體循環(huán)法〔5〕和單向灌流法，前者由于長時(shí)間以較高流速回流供試液，會(huì)對(duì)腸黏膜造成損傷，導(dǎo)致藥物在腸道內(nèi)吸收增大，使測(cè)得值與真實(shí)值產(chǎn)生較大偏離;而后者以較低流速對(duì)一定腸段進(jìn)行灌流，保證研究部位的淋巴和血液循環(huán)系統(tǒng)完整，因此明顯優(yōu)于離體法，其中單向灌流法與人體有良好的相關(guān)性而被應(yīng)用最多〔6，7〕。

因腸道對(duì)水分部分吸收，所以需要對(duì)灌流液體積的變化進(jìn)行校正。有研究曾采用不被腸吸收的酚紅為標(biāo)示物以標(biāo)示灌流液體積變化〔8〕，但酚紅也有一定吸收，且干擾藥物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和分析測(cè)定〔9〕。與酚紅法相比，重量法能明顯減小實(shí)驗(yàn)誤差，更真實(shí)地反映腸道吸收水分的實(shí)際情況，且降低了檢測(cè)的工作量，是一種值得推廣的大鼠在體腸吸收研究方法。灌流速度在一定程度上代表腸道蠕動(dòng)的生理狀態(tài)，在健康志愿者體內(nèi)腸灌流實(shí)驗(yàn)中，灌流速度多選用2～3 ml/min，由于大鼠腸道的內(nèi)徑為人腸道的1/10〔11〕，因次本實(shí)驗(yàn)將大鼠腸灌流速度選為0.2 ml/min。不同質(zhì)量濃度下，洛伐他汀的吸收速率有顯著差異，且有高濃度飽和現(xiàn)象，表明藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)可能有載體的參與，有待進(jìn)一步研究。洛伐他汀在小腸各段間吸收速率常數(shù)無顯著差異，表明其無特定吸收部位。洛伐他汀在小腸各段均吸收較好，故適宜將其制成緩釋制劑，延長藥物在小腸的滯留時(shí)間，以減少服用次數(shù)，提高其生物利用度和患者的順應(yīng)性。

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