李越峰，蘇云明，嚴(yán)興科，李廷利

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅蘭州 730000;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2.博士后流動站，3.藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

四逆散為東漢張仲景《傷寒論》首載，由柴胡、白芍、枳實(shí)和甘草4味中藥組成，是和解少陽、調(diào)和肝脾的基礎(chǔ)方劑，具有解郁透熱、疏肝理脾和宣散氣血郁滯之功。研究中藥復(fù)方發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)有助于闡明其藥理作用機(jī)制。中藥指紋圖譜技術(shù)如色譜法和光譜法為研究中藥復(fù)方化學(xué)成分提供了技術(shù)手段[1－4]。本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，四逆散凍干粉具有改善睡眠和提高睡眠質(zhì)量的作用[5－6]。本研究采用反相HPLC法[7]獲得四逆散凍干粉指紋圖譜，通過四逆散凍干粉血中移行成分分析、腦脊液中移行成分分析并觀察四逆散凍干粉對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響，初步探討四逆散改善睡眠作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為闡明其改善睡眠的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200～220 g;昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號:黑動字第P00101006。

1.2 藥物

柴胡為傘形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)(北柴胡)，購于河北省安國市康信義藥材行;白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，枳實(shí)(炙)為蕓香科常綠小喬木植物酸橙(Citrus aurantium L.)的干燥幼果，甘草(炙)為豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根，均購自哈爾濱市世一堂中藥飲片廠;以上藥材均經(jīng)本單位生藥學(xué)教研室都曉偉教授鑒定。

1.3 主要試劑和儀器

戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;甘草酸單銨鹽、柴胡皂苷C和昔奈福林(HPLC測定純度均＞98%)，成都思科華生物技術(shù)有限公司;高氯酸(分析純)，天津市東方化工廠;胰蛋白酶，上海伯奧生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純)，上海山浦化工有限公司;甲醇(HPLC級)和乙腈(HPLC級)，美國迪馬試劑公司;甘草次酸、芍藥苷、柚皮苷和橙皮苷，中國藥品生物制品檢定所，HPLC測定其純度均＞98%。SHIMADZU島津2010-A高效液相色譜儀、Kromasil色譜柱和 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)保護(hù)柱，購自大連依利特分析儀器有限公司;微孔純水制備系統(tǒng)和超級恒溫器，重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;KDC-40低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;SK-1型快速混勻器，江蘇醫(yī)療儀器廠;B3200S-T超聲震蕩儀，必能信超聲上海有限公司;翻正反射測定儀自制。

1.4 四逆散凍干粉的制備

精密稱取藥材適量，加入10倍體積水，煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至稠膏狀，并于 70℃水浴濃縮至 0.8 kg(生藥)·L－1，采用先煎煮后冷凍干燥的工藝制備四逆散凍干粉。工藝如下:－40℃制冷，－20℃保凍 2 h，－10℃保凍16 h，20℃干燥5 h，35℃二次干燥2 h。此工藝條件下，獲得的四逆散凍干粉凍型飽滿，復(fù)水性好，呈淡黃色，網(wǎng)狀疏松，水分＜1%。采用HPLC法測定其中芍藥苷≥2.74%，柴胡皂苷A≥2.32%，柚皮苷≥3.31%，甘草次酸≥2.70%。精密稱取四逆散凍干粉0.5 g置容量瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，超聲提取40 min，冷卻，搖勻，濾過，再用 0.45 μm 濾膜過濾，HPLC 分析，進(jìn)樣量 10 μl。

1.5 四逆散凍干粉給藥后大鼠血清樣品的制備

稱取四逆散凍干粉 20 g，加水溶解配成500 g·L－1溶液，ig 給予大鼠，劑量為 5.0 g·kg－1，每天1次，連續(xù)7 d。于末次給藥后5 h ip給予大鼠1%戊巴比妥鈉溶液4 m·lkg－1麻醉，5 min后肝門靜脈取血，每只5 ml，999×g離心10 min，取血清2.0 ml。隨機(jī)將2只大鼠血清合并，加入甲醇10 ml快速混勻，密閉超聲提取10 min，999×g離心10 min，取上清液在40℃恒溫條件下減壓回收至干，殘?jiān)约状? ml溶解，0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)樣10 μl進(jìn)行移行成分分析。

1.6 四逆散凍干粉及其主要血清移行成分昔奈福林、芍藥苷、柴胡皂苷C和甘草次酸給藥后大鼠腦脊液樣品的制備

取Wistar大鼠70只，平均分為7組，分別為正常對照組、四逆散凍干粉12 g·kg－1組、血清移行成分昔奈福林38 mg·kg－1、芍藥苷87 mg·kg－1、柴胡皂苷 C 42 mg·kg－1和甘草次酸39 mg·kg－1組及其配伍(昔奈福林∶芍藥苷∶柴胡皂苷C∶甘草次酸=8.5∶1∶1.5∶6.5)(各成分在血清移行成分中的質(zhì)量比)206 mg·kg－1組。稱取凍干粉20 g，加水溶解配成500 g·L－1溶液，ig給藥，正常對照組給予等體積蒸餾水。每天1次，連續(xù)7 d。于末次給藥后5 h ip給予大鼠1%戊巴比妥鈉溶液4 ml·kg－1麻醉，5 min后用1 ml注射器于枕骨大孔抽取腦脊液，并將10只大鼠腦脊液合并，加入甲醇5 ml快速混勻，密閉超聲提取10 min，999×g離心10 min，取上清液在40℃恒溫條件下減壓回收至干，殘?jiān)约状? ml溶解，0.45 μm 濾膜過濾，取 10 μl進(jìn)樣進(jìn)行移行成分分析。

1.7 大鼠血清和腦脊液中移行成分分析

取10 μl上述制備的血清和腦脊液樣品用HPLC法進(jìn)行移行成分分析。色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度見表 1;檢測波長:210 nm，240 nm;流速:1.0 m·lmin－1;柱溫:30℃。

1.8 戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的測定

取小鼠140只，置實(shí)驗(yàn)室1周，使之適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)分組同1.6，每組20只。每天給藥1次，連續(xù)7 d。于末次給藥前8 h禁食，給藥60 min后ip給予戊巴比妥鈉50 mg·kg－1，室內(nèi)溫度保持在20℃，濕度40%。用翻正反射測定儀測定小鼠睡眠時間，以翻正反射消失達(dá)1 min以上者即為入睡，觀察并記錄翻正反射消失和恢復(fù)時間。翻正反射消失至恢復(fù)時間為睡眠時間。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Tab.1 Gradient program of HPLC for analysis of constituents in serum and cerebrospinal fluid of rats

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中四逆散凍干粉移行成分

HPLC法測定結(jié)果(圖1)表明，四逆散凍干粉每天1次，連續(xù)給藥7 d后大鼠血清樣品中有14種移行成分，經(jīng)來源認(rèn)定研究認(rèn)為，其中2號峰為昔奈福林，4號為芍藥苷，12號為柴胡皂苷C，14號為甘草次酸。

2.2 大鼠腦脊液中四逆散凍干粉移行成分

經(jīng)過綜合分析，腦脊液中除戊巴比妥鈉成分外，并無四逆散凍干粉血清移行成分。如圖2所示，正常腦脊液和給藥組腦脊液中的*號成分保留時間及紫外吸收光譜一致為同一物質(zhì)，表明是內(nèi)源性物質(zhì)。分析各峰面積比值(圖3)，四逆散凍干粉、芍藥苷、甘草次酸、昔奈福林和柴胡皂苷C均可以使腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)峰面積增加，其中四逆散凍干粉組是正常腦脊液峰面積的12.5倍;血清移行成分配伍組腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)峰面積高于四逆散凍干粉組，是四逆散凍干粉組的3.2倍。

Fig.1 Analysis of transitional composition in blood serum of freeze-dried Sini powder(SP).The rats were ig given SP once a day consecutively for seven days.The serum was prepared 5 h after the last drug administration.Transitional ingredients of SP in blood were analyzed by using HPLC method.A:pentobarbital;B:mixed reference substances(a:paeoniflorin;b:naringin;c:hesperidin;d:monopotassium glycyrrhizinate;g:glycyrrhetinic acid);C:normal serum;D:serum in SP given rats;E:SP.

Fig.2 Contrast analysis on transitional constituents in serum and cerebrospinal fluid of SP.The rats were ig given the corresponding drug once a day consecutively for seven days.The blood and cerebrospinal fluid were prepared 5 h after the last drug administration.The transitional ingredients of SP in blood and cerebrospinal fluid were analyzed by using HPLC method.1:pentobarbital;2:mixed reference substances(a:paeoniflorin;b:naringin;c:hesperidin;d:monopotassium glycyrrhizinate;g:glycyrrhetinic acid);3:normal serum;4:serum in SP 12 g·kg －1given rats;5 －11:cerebrospinal fluid，in which 5:normal;6:SP 12 g·kg －1;7:paeoniflorin 87 mg·kg －1;8:synephrine 38 mg·kg －1;9:saikosaponin C 42 mg·kg －1;10:glycyrrhetinic acid 39 mg·kg －1;11:prescription of SP serum transitional ingredients(PSTI)(synephrine∶paeoniflorin∶saikosaponin C∶glycyrrhetinic acid=8.5∶1∶1.5∶6.5)(mass ratio)206 mg·kg －1.*:endogenous substance.

Fig.3 Chromatograms of constituents in cerebrospinal fluid after rats were ig given SP and its four serum transitional components.A:normal;B:SP 12 g·kg－1;C:paeoniflorin 87 mg·kg －1;D:synephrine 38 mg·kg －1;E:saikosaponin C 42 mg·kg－1;F:glycyrrhetinic acid 39 mg·kg－1;G:PSTI 206 mg·kg－1.*:endogenous substance.

2.3 四逆散凍干粉及其血清移行成分改善睡眠作用

四逆散凍干粉、昔奈福林、芍藥苷、柴胡皂苷C、甘草次酸及其配伍改善睡眠作用的比較結(jié)果見表2。與正常對照組比較，芍藥苷、甘草次酸、昔奈福林和柴胡皂苷C對閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間無明顯影響，四逆散凍干粉和血清移行成分配伍均可明顯延長小鼠睡眠時間(P＜0.01)，血清移行成分配伍組優(yōu)于四逆散凍干粉整方組(P＜0.01)。

Tab.2 Effect of SP and PSTI on rat sleep time induced by pentobarbital sodium

3 討論

通過四逆散凍干粉血清中移行成分分析，四逆散凍干粉連續(xù)給藥7 d后血清樣品中有14種移行成分，經(jīng)來源認(rèn)定研究認(rèn)為，其中2號成分為昔奈福林，4號成分為芍藥苷，12號成分為柴胡皂苷C，14號成分峰為甘草次酸。

經(jīng)過綜合分析，腦脊液中除戊巴比妥鈉成分外，并無血中移行成分的進(jìn)入，正常腦脊液和給藥組腦脊液中的*號成分保留時間及紫外吸收光譜一致為同一物質(zhì)，說明是內(nèi)源性物質(zhì)。從峰面積比值來看，給予四逆散凍干粉后腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)峰面積約是正常腦脊液峰面積的12.5倍。血清中四逆散凍干粉的移行成分昔奈福林、芍藥苷、柴胡皂苷C和甘草次酸均可以使腦脊液中該內(nèi)源性物質(zhì)峰面積高于正常腦脊液峰面積，但不及四逆散凍干粉整方作用，且血清移行成分配伍組腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)峰面積是四逆散凍干粉組的3.2倍。綜上所述，血清移行成分昔奈福林、芍藥苷、柴胡皂苷C和甘草次酸可能是四逆散凍干粉改善睡眠作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

給藥后腦脊液中的成分含量明顯高于正常腦脊液含量，說明連續(xù)給藥后大鼠腦脊液中的內(nèi)源性物質(zhì)增多，至于該成分為何種物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。在對腦脊液成分分析的研究中發(fā)現(xiàn)，四逆散凍干粉發(fā)揮改善睡眠作用時表現(xiàn)出一種內(nèi)部調(diào)控作用，這在某種程度上解釋了四逆散凍干粉在改善睡眠作用方面所具有的獨(dú)特的藥理作用，與化學(xué)合成藥物相比具有較大的優(yōu)勢[8]。另外，本研究結(jié)果表明，昔奈福林、芍藥苷、柴胡皂苷C和甘草次酸4種成分及其配伍、四逆散凍干粉整方均能使腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)峰面積增高，血清移行成分配伍作用最強(qiáng)。以血清移行成分作為目標(biāo)成分，結(jié)合藥效學(xué)研究，確認(rèn)四逆散凍干粉改善睡眠作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為四逆散凍干粉改善睡眠的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究觀察了四逆散凍干粉及其血清移行成分對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，四逆散凍干粉可明顯延長戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間，血清移行成分配伍組優(yōu)于四逆散凍干粉組，芍藥苷、甘草次酸、昔奈福林和柴胡皂苷C單用具有延長小鼠睡眠時間的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究通過對四逆散凍干粉血中移行成分分析、腦脊液中移行成分分析及四逆散凍干粉對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間影響的藥效研究，初步確認(rèn)四逆散凍干粉的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能是其血清中移行成分昔奈福林、芍藥苷、柴胡皂苷C及甘草次酸。

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