宋書(shū)輝，于 冰，徐 旭，趙專(zhuān)友，湯立達(dá)

(1.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸〔Angelica sinensis(Oliv.)Diels〕的干燥根，味甘、辛、性溫，是常用活血化瘀中藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其對(duì)心腦血管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)具有廣泛的藥理效應(yīng)[1－2]。當(dāng)歸，素有“十方九歸”之稱(chēng)，至今仍廣泛應(yīng)用于臨床，相關(guān)研究已證實(shí)當(dāng)歸具有抗血小板聚集作用[3－5]。大量的研究表明，當(dāng)歸對(duì)缺血組織有保護(hù)作用[6－11]。當(dāng)歸在擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化、清除自由基和改善血液流變學(xué)等方面具有良好的藥理作用[12]。血塞通為已經(jīng)上市的并且在活血化瘀、通脈活絡(luò)、抑制血小板聚集和增加腦血流量方面的療效在臨床上已得以驗(yàn)證與肯定。本研究通過(guò)對(duì)當(dāng)歸主要有效成分當(dāng)歸總苯酞(A.sinensis total phthalide，ASTP)藥理作用的探討，觀察其在大鼠腦缺血再灌注損傷方面的作用，以便為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并以血塞通為陽(yáng)性對(duì)照藥，主要用于對(duì)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的驗(yàn)證以及與ASTP在大鼠腦缺血再灌方面的療效進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要儀器

當(dāng)歸是由天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部按照2010年版《中國(guó)藥典》一部當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，符合規(guī)定。每20 g當(dāng)歸生藥材能夠提取1 g ASTP，以1%吐溫-80配置成所需濃度的乳濁液，供大鼠灌胃用。血塞通，云南白藥集團(tuán)文山七花有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)20091121，規(guī)格:每粒50 mg。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)71K1225，以磷酸鹽緩沖液配制2%溶液供腦組織染色用。高分子右旋糖酐，相對(duì)分子質(zhì)量50萬(wàn)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所科技公司產(chǎn)品，批號(hào)100608，白色粉末，以生理鹽水制成10%濃度供動(dòng)物靜脈注射造型用。異氟烷，分析純，每瓶100 ml，山東科源制藥有限公司，批號(hào):20100214。吐溫-80，成都市方舟化學(xué)試劑廠，化學(xué)純，批號(hào):20090903;丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所;PK121R低溫冷凍離心機(jī)，意大利ALC公司產(chǎn)品。COOLPIX955數(shù)碼相機(jī)，日本尼康公司產(chǎn)品。病理圖像采集與分析系統(tǒng)，北京航空航天大學(xué)圖像中心產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物和暫時(shí)性腦缺血再灌注模型的制備

雄性SD大鼠，250～260 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(京)2007-0001。

60只SD大鼠，分為6組，每組10只，假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥血塞通 0.05 g·kg－1組、ASTP 0.05，0.1 和0.2 g·kg－1組。假手術(shù)組和模型組分別ig給予1%吐溫-80乳濁液，給藥體積均為10 ml·kg－1，ig給藥，連續(xù)7 d。于第7天給藥30 min之后，進(jìn)行暫時(shí)性局部腦缺血模型的制備。雄性 SD大鼠，250～260 g，用 24%水合氯醛(350 mg·kg－1，ip)麻醉，之后將大鼠仰臥固定，沿頸部正中作2 cm長(zhǎng)的皮膚切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈并穿線2根備用。再分離出頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈下方小心分離出頸內(nèi)動(dòng)脈及翼突腭動(dòng)脈，將一根直徑0.21～0.23 mm的尼龍線從頸外動(dòng)脈插入，于分叉的分支處結(jié)扎即完成手術(shù)。若要進(jìn)行再灌注，則將尼龍線往回抽至頸外動(dòng)脈處即可實(shí)現(xiàn)再灌[6]。

1.3 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、腦梗死面積和腦水腫的測(cè)定

分別于再灌前、再灌2和24 h進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分[13]。評(píng)分后處死大鼠，取出全腦，冠狀面間隔2 mm均勻切片6片，間隔取出大腦切片4片放入2%TTC染液中，進(jìn)行染色。取大腦切片1片以“重量求面積法”計(jì)算出梗死組織重量占全腦重的百分比作為梗死面積的比例[9]。再另取大腦切片1片稱(chēng)重后，置于50℃烘箱中烤至恒重，稱(chēng)量其干重，計(jì)算大鼠大腦含水百分率(%)=(新鮮腦重－干燥后腦重)/新鮮腦重×100%，腦水腫抑制率(%)=實(shí)驗(yàn)組大腦含水百分率－模型組大腦含水百分率/模型組大腦含水百分率×100%。

1.4 MDA含量和SOD活性的檢測(cè)

按照MDA和SOD試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.5 大鼠腦膜血管流量測(cè)定

動(dòng)物分組及給藥方法同1.2。于第7天給藥后1 h，ip給予20%烏拉坦(1 g·kg－1)麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，立體定位于AP3，MR3。切開(kāi)顱骨頂部皮膚暴露顱骨，用一大小約0.5 cm×0.5 cm的薄膜貼于顱骨上，其上方置激光探頭，調(diào)節(jié)探頭高度及位置，使血流量達(dá)到65～80多普勒流量單位(PU，ml·min－1)，穩(wěn)定20 min，記錄流量作為基礎(chǔ)值。然后經(jīng)股靜脈推注10%高分子右旋糖酐5 ml·kg－1造成微循環(huán)障礙;正常對(duì)照組不造型，只推注等量的生理鹽水。記錄推注10%高分子右旋糖酐后5，10，15，20，30，45，60，90和120 min的血流量值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸總苯酞對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的影響

表1結(jié)果顯示，再灌前，模型組及各給藥組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，給予ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分顯著低于模型組(P＜0.05)。再灌2 h 后，ASTP 0.05，0.1和0.2 g·kg－1神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分分別降低 15.5%，28.7%和29.9%，再灌24 h后，神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分分別降低11.9%，25.3%和37.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。陽(yáng)性對(duì)照藥血塞通也能明顯改善神經(jīng)功能障礙，與 ASTP 0.2 g·kg－1相當(dāng)。

Tab.1 Effect of Angelica sinensis total phthalide(ASTP)on neurological score in ischemia/reperfusion(I/R)rats

2.2 當(dāng)歸總苯酞對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響

圖1和表2結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1可明顯縮小腦缺血再灌注損傷所致的大鼠腦梗死面積，分別縮小41.7%和49.6%(P＜0.05)，ASTP 0.05 g·kg－1無(wú)明顯作用。

Fig.1 Effect of ASTP on cerebral infarction rats.A:sham group;B:model group;C，D and E:ASTP0.05，0.1 and 0.2 g·kg－1groups;F:Xuesaitong group.The normal tissue showed red after staining while the part of infarction showed white.

Tab.2 Effect of ASTP on rate of cerebral infarction area in I/R rats

2.3 當(dāng)歸總苯酞腦缺血再灌注大鼠腦水腫的影響

表3結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦含水百分率為(76.3±1.1)%。與模型組相比，大鼠給予 ASTP 0.1和0.2 g·kg－1，每天1 次，連續(xù)7 d 后，可不同程度減輕腦水腫，分別減輕42%和52%(P＜0.05)，陽(yáng)性對(duì)照藥血塞通使腦水腫減輕 39%(P＜0.05)。但仍舊明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。

2.4 當(dāng)歸總苯酞對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

表4結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組MDA含量明顯增加，而SOD活性明顯下降，表明大鼠腦缺血再灌注損傷后引發(fā)明顯腦脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。ASTP可明顯降低MDA生成，同時(shí)SOD活性有所增加;與模型對(duì)照組比較，MDA最大降低幅度達(dá)62%，SOD活性最大升高幅度達(dá)77%。

Tab.3 Effect of ASTP on brain edema in I/R rats

Tab.4 Effect of ASTP on malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in I/R rats

2.5 當(dāng)歸總苯酞對(duì)高黏滯血癥大鼠軟腦膜微循環(huán)的影響

圖2結(jié)果顯示，造模后5 min開(kāi)始，模型組PU值明顯降低(P＜0.01)。與模型組相比，給ASTP 0.05 g·kg－1組在造模后60 min開(kāi)始PU值明顯升高，ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1組從30 min 開(kāi)始明顯升高(P＜0.05)，但均低于同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組PU值。造模后5～30 min期間，ASTP各組PU值明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，從60 min開(kāi)始逐漸恢復(fù)，說(shuō)明給予ASTP對(duì)改善腦膜微循環(huán)有一定的作用。

Fig.2 Effect of ASTP on pial vascular blood flow(PU)in rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠給予ASTP后，可以縮小造模導(dǎo)致的腦梗死體積，減輕腦水腫，改善軟腦膜微循環(huán)。當(dāng)歸具有廣泛的藥理作用，具有補(bǔ)血理氣之功效，其作用范圍涉及機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)，當(dāng)歸可以通過(guò)改善血栓素A2與前列環(huán)素之間的平衡，提高血栓素A2與前列環(huán)素的比值，抑制血小板釋放5-HT[14－15]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦 MDA 含量降低，SOD活性增加。文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)歸具有抗氧化與抗衰老作用，可明顯提高D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠大腦皮質(zhì)SOD活性，提高Ca-ATP酶的活性，降低脂褐素含量[16－17]。說(shuō)明 ASTP 通過(guò)抗氧化作用減輕腦缺血再灌注的損傷。

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