樊 華，張 鵬，康 強(qiáng)，王秀英

(1.遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧沈陽 110023;2.沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧沈陽 110000)

蛇毒類凝血酶屬胰蛋白酶家族中的絲氨酸蛋白酶，是蝮亞科蛇毒中一個具有促凝血活性的組成成分，能直接作用于纖維蛋白原，促進(jìn)血液凝固。據(jù)報(bào)道，很多蛇毒成分已用于出血或血栓性疾病的診斷和治療[1－3]。研究表明，蛇毒類凝血酶的主要藥理學(xué)作用是對凝血因子、纖溶活性和血小板功能的影響[1－3]，如已上市的注射用血凝酶(hemocoagulase atrox for injection，HAI)，又名巴曲酶(batroxobin)，取自大具竊蝮蛇(矛頭蛇，Bothrops atrox)，能夠縮短正常人鞣花酸活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplatin，APTT)，且其主要成分巴曲酶能夠促進(jìn)血小板聚集等[4]。本研究應(yīng)用兔作為實(shí)驗(yàn)動物觀察蛇毒類凝血酶新型研發(fā)藥—— 注射用尖吻蝮蛇(百步蛇，Agkistrodor acutus)凝血酶(hemocoagulase actutus for injection，Hem)對兔凝血功能指標(biāo)的影響，觀察其在治療血液疾病方面是否存在優(yōu)于已上市藥物的療效，為其進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

普通級日本大耳白健康兔40只，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)，掛牌標(biāo)記，購自沈陽市雙義實(shí)驗(yàn)動物研究所，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2003-0012;實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SYXK(遼)2008-0008;動物室溫度:19.6～21.8℃，濕度:40%～70%。Hem由沈陽守正生物技術(shù)有限公司提供，由蓬萊諾康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:080703;規(guī)格:每瓶含1 U Hem;用2 ml生理鹽水溶解，靜脈注射，也可肌內(nèi)注射，成人每次1～2 U，質(zhì)控材料由沈陽守正生物技術(shù)有限公司提供。陽性對照HAI，由瑞士素高藥廠生產(chǎn)，每瓶含1克氏單位(Klobusitzky unit，KU)的血凝酶;成人每次1.0～2.0 KU，緊急情況下，立即靜脈注射1.0 KU，同時肌內(nèi)注射1.0 KU。凝血酶時間(thrombin time，TT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、血漿纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)和APTT檢測試劑盒，保定天岳生物工程有限公司生產(chǎn);0.9%氯化鈉注射液，遼寧味邦生物制藥有限公司生產(chǎn)。C2000-4型高性能血凝儀，北京普利生儀器有限公司;MEK-6318血球計(jì)數(shù)儀:日本光電工業(yè)株式會社。

1.2 動物分組和給藥

日本大耳白兔隨機(jī)分為正常對照組(生理鹽水注射液)、Hem 0.25，0.5 和 1.0 U·kg－1及 HAI 1.0 KU·kg－1組，每組 8 只，經(jīng)耳緣靜脈一次性 iv給予，給藥體積1 m·lkg－1。

1.3 凝血時間的測定

給藥前(0 min)，給藥后 10 min，30 min，2 h和12 h由耳緣靜脈取血，應(yīng)用Lee-White試管法[5]測定全血凝血時間(coagulation time，CT)。

1.4 血小板計(jì)數(shù)的測定

測定CT的同時，自耳靜脈取血3 ml(抗凝劑∶血=1∶9，V/V)，應(yīng)用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)給藥前和給藥后10 min，30 min，2 h 及 12 h 血小板(platelet，PLT)。

1.5 凝血因子的測定[6－8]

取1.4制備的抗凝血，500×g離心15 min，取上層血漿，應(yīng)用C2000-4高性能血凝儀測定PT，TT，F(xiàn)IB 和 APTT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 注射用尖吻蝮蛇凝血酶對兔凝血時間的影響

由表1可見，正常對照組各時間點(diǎn)CT無明顯變化，給予 Hem 0.25，0.5 和 1.0 U·kg－1及 HAI 1.0 KU·kg－1后10 min～12 h與給藥前相比CT 明顯縮短(P＜0.05)。

2.2 注射用尖吻蝮蛇凝血酶對兔血小板計(jì)數(shù)的影響

由表2可見，正常對照組各時間點(diǎn)PLT無明顯變化;Hem 0.25 和0.5 U·kg－1及 HAI 1.0 KU·kg－1給藥后各時間點(diǎn)PLT與給藥前比較未見明顯變化;Hem 1.0 U·kg－1給藥后10 和30 min其 PLT 均明顯高于給藥前(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of hemocoagulase actutus for injection(Hem)on coagulation time(CT)of rabbits

Tab.2 Effect of Hem on platelet(PLT)count of rabbits

2.3 注射用尖吻蝮蛇凝血酶對兔凝血因子的影響

由表3 可見，正常對照、Hem 0.25 和0.5 U·kg－1組各時間點(diǎn) APTT 無明顯變化，Hem 1.0 U·kg－1組10 min～2 h及 HAI 1.0 KU·kg－130 min～12 h 組APTT明顯低于給藥前(P＜0.05)。由表4可見，正常對照組各時間點(diǎn)PT 無明顯變化，Hem 0.25 U·kg－1組10 min，0.5 U·kg－1組10 min～2 h 和1.0 U·kg－1組10～30 min及HAI 1.0 KU·kg－1組10～30 min PT 明顯低于給藥前(P＜0.05)。由表5可見，正常對照、Hem 0.25 和0.5 U·kg－1組各時間點(diǎn)TT 無明顯變化，Hem 1.0 U·kg－1組10 min～12 h 和HAI 1.0 KU·kg－1組30 min TT明顯低于給藥前(P＜0.05)。由表6可見，正常對照組各時間點(diǎn)FIB無明顯變化，Hem 0.25 U·kg－1組30 min，0.5 U·kg－1組10～30 min 和1.0 U·kg－1組10 min～2 h及 HAI 1.0 KU·kg－1組10～30 min FIB 明顯高于給藥前(P＜0.05)。

Tab.3 Effect of Hem on activated partial thromboplatin(APTT)of rabbits

Tab.4 Effect of Hem on prothrombin time(PT)of rabbits

Tab.5 Effect of Hem on thrombin time(TT)of rabbits

Tab.6 Effect of Hem on fibrinogen(FIB)of rabbits

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40余種蛇毒中含有類凝血酶成分，并有20余種先后得到分離和純化[3]，Hem就是其中之一。蛇毒類凝血酶在臨床上主要用于止血、抗血栓和診斷試劑等方面。本研究通過檢測CT，PLT以及PT，TT，APTT和FIB 4個凝血因子，觀察Hem對血小板功能和凝血因子的影響。研究結(jié)果表明，給予兔 Hem 0.25，0.5 和 1.0 U·kg－1和HAI 1.0 kU·kg－1后 10 min，30 min，2 h 和 12 h 4個不同時間點(diǎn)與給藥前相比CT明顯縮短(P＜0.05)。同時 Hem 1.0 U·kg－1給藥后10 min 與給藥前相比即可見PLT明顯增高(P＜0.05)，可維持至30 min(P＜0.05)，提示Hem可以促凝血，Hem 1.0 U·kg－1作用較顯著。另外，HAI在給藥后10 min～12 h與給藥前比較PLT無明顯變化，考慮其凝血作用機(jī)制可能并不是通過增加PLT實(shí)現(xiàn)的，這與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[9－10]。不同來源的蛇毒類凝血酶其對血漿蛋白的作用方式并不相同。綜合PT，TT，F(xiàn)IB和APTT 4項(xiàng)指標(biāo)，Hem對PT，TT，F(xiàn)IB和APTT在不同時間點(diǎn)均有不同程度的影響，Hem 1.0 U·kg－1均在給藥后10 min即出現(xiàn)明顯的藥效作用，特別是可以使TT縮短并維持至12 h。其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)過程中通過兔耳緣靜脈反復(fù)多次采血，血液質(zhì)量影響指標(biāo)檢測結(jié)果的可靠性。耳靜脈采血無疑是一種方便且創(chuàng)傷小的方法，但對操作者的技術(shù)要求和實(shí)驗(yàn)動物自身的要求較為嚴(yán)格，故建議在實(shí)驗(yàn)操作過程中應(yīng)熟練掌握采血技術(shù)并嚴(yán)格控制時間，同時可通過實(shí)驗(yàn)組別、采血順序設(shè)計(jì)和采血人員交替等方法盡量減少人為誤差。

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