張立濤 于織波 趙鶴齡

膿毒癥是由于感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，并常導(dǎo)致組織損傷和器官功能異常，進一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征。膿毒癥時往往合并心肌細胞損傷，心臟功能障礙，且發(fā)生率很高，機制復(fù)雜，其中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)在此過程中發(fā)揮了重要作用。已有資料表明ICAM-1是心肌炎性反應(yīng)時中性粒細胞游走、聚集、發(fā)揮細胞毒作用必不可缺的跨膜蛋白質(zhì)，與心肌損傷明顯相關(guān)。他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一種廣泛應(yīng)用的降脂藥物，并可以減少患冠心病的風(fēng)險。除此之外，他汀類藥物尚有與降低血脂無關(guān)的多種生物作用，這種多效性包括:抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝血、穩(wěn)定血管內(nèi)皮等，因此理論上他汀類藥物可以改善膿毒癥患者的預(yù)后。本實驗主要通過免疫組化的方法，觀察膿毒癥模型大鼠心肌細胞ICAM-1 的表達，并評價辛伐他汀預(yù)處理對其表達的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理清潔級健康雌性Wistar 大鼠60 只，體重200 ～250 g(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證編號:909043)。飼養(yǎng)于恒溫(20℃)清潔飼養(yǎng)室，喂養(yǎng)普通大顆粒飼料，給予充足水分，通風(fēng)良好，溫度適宜。經(jīng)1 周適應(yīng)期后利用隨機數(shù)字表完全隨機化分組為正常組、膿毒癥組和辛伐他汀組，每組20 例。辛伐他汀組開始喂養(yǎng)辛伐他汀20 mg/kg(舒降之，默沙東)，用0.9%氯化鈉溶液配成等濃度藥液灌胃(5 mg/ml)，1 次/d，持續(xù)2 周。正常組和膿毒癥組用0.9%氯化鈉溶液灌胃(4 ml/kg)，1 次/d，持續(xù)2 周。2 周后膿毒癥組和辛伐他汀組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，各組于術(shù)后48 h 分別取大鼠左心室心肌組織，置入10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 動物模型制備采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)［1］建立膿毒癥模型。麻醉前禁食8 h，以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在實驗臺上。常規(guī)消毒腹部皮膚，于腹部皮膚正中做切口，長約2 cm，打開腹腔后小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。盲腸如有糞便，則輕輕將其擠向與其相連的大腸，在盲腸與小腸及大腸交界處，用4-0 絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸，避免結(jié)扎回腸和盲腸系膜血管。結(jié)扎完畢后仔細檢查，保持腸道通路暢通。在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用18 號針頭穿刺3 次，擠出適量腸內(nèi)容物，并留置一寬約0.2 cm，長約3 cm橡皮引流條貫通盲腸，以防針孔閉合，輕輕將腸管放回原處，逐層縫合，關(guān)閉腹腔。

1.3 方法

1.3.1 石蠟切片行S-P 三步法免疫組織化學(xué)法染色:ICAM-1一抗為兔抗大鼠IgG 多克隆抗體(購于武漢博士德生物工程有限公司)，抗體稀釋比例為1∶200。

1.3.2 染色結(jié)果判定:ICAM-1 陽性染色為在細胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉著。陽性細胞必須具備:①細胞結(jié)構(gòu)清晰;②陽性顆粒定位、定性好;③著色明顯高于背景。評分標(biāo)準:參照Soslow［2］的評分方法，應(yīng)用美國多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)分析:每張切片隨機取5 個(×200)高倍視野，采用陽性細胞顯色強度和陽性細胞百分比雙重判定進行評分，并將二者評分乘積作為最終評分進行統(tǒng)計學(xué)分析。評分標(biāo)準:①顯色強度判定:陰性為0 分，弱陽性為1 分，陽性為2 分，強陽性為3分;②陽性細胞百分比判定:著色細胞占總細胞數(shù)＜1%為0分，1%～10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～80%為3 分，81%～100%為4 分;③以陽性細胞顯色強度和陽性細胞百分比得分之積作為最終結(jié)果進行判定，0 分為陰性，1 ～4 為弱陽性(+)，5 ～8 分為陽性(++)，9 ～12 為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，等級資料采用多個獨立樣本比較的Kruskal-Wallis H 檢驗及成對比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況膿毒癥組大鼠術(shù)后表現(xiàn)出無活力、反應(yīng)差、發(fā)紺、立毛和呼吸急促的特點。打開腹腔后可見血性腹水，可聞及惡臭味，并發(fā)現(xiàn)部分大鼠腸管水腫，盲腸發(fā)黑，可見膿苔。相比之下，辛伐他汀組大鼠表現(xiàn)相對較輕。

2.2 ICAM-1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(1)正常組大鼠心肌細胞ICAM-1 蛋白表達微量。(2)膿毒癥組大鼠心肌細胞胞漿內(nèi)可見較多棕黃色或棕色顆粒沉著，與正常組比較明顯增加(P＜0.05)。(3)辛伐他汀組大鼠心肌細胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒與膿毒癥組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖1 ～3，表1。

圖1 正常組心肌細胞ICAM-1 的蛋白表達(SP×400)

圖2 膿毒癥組心肌細胞ICAM-1 的蛋白表達(SP×400)

圖3 辛伐他汀組心肌細胞ICAM-1 的蛋白表達(SP×400)

表1 3 組大鼠心肌細胞ICAM-1 蛋白表達情況比較n=20，例(%)

3 討論

本研究參照相關(guān)文獻采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，通過盲腸的結(jié)扎和穿孔，使有菌的腸內(nèi)容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發(fā)廣泛的全身性炎性反應(yīng)。結(jié)果表明:術(shù)后大鼠出現(xiàn)精神倦怠、躁動、寒戰(zhàn)、發(fā)紺、腹脹和呼吸急促的特點。打開腹腔后可見血性腹水，可聞及惡臭味，并發(fā)現(xiàn)部分腸管水腫，盲腸發(fā)黑，可見膿苔。以上均提示膿毒癥模型制備成功。

ICAM-1 是免疫球蛋白超家族的細胞表面跨膜蛋白質(zhì)，是由細胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細胞與細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)之間相互作用的一類膜表面糖蛋白分子，廣泛表達于各種組織細胞表面。其與配體淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)相結(jié)合，參與細胞信號傳導(dǎo)與活化、細胞的伸展和移動、生長及分化、炎性反應(yīng)、血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及創(chuàng)傷愈合等一系列重要的生理病理過程。正常情況下，心肌細胞表面ICAM-1 表達量極低，但在膿毒癥時，細胞因子如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等和脂多糖(LPS)可使心肌細胞ICAM-l 表達增加，而ICAM-l 在介導(dǎo)白細胞由血管內(nèi)向血管外游走，并造成心肌損傷的過程中發(fā)揮了重要作用。van Griensven 等［3］證實ICAM-l 基因已被敲除的小鼠在膿毒癥模型中的炎性反應(yīng)明顯減弱，肺臟、肝臟中性粒細胞浸潤明顯減少，組織損傷相對較輕，死亡率明顯低于對照組。Davani 等［4］發(fā)現(xiàn):LPS 可使心肌組織ICAM-1 表達明顯增加，并使左心室心肌收縮力明顯減弱，作者認為這與ICAM-l 所致心肌組織中性粒細胞浸潤關(guān)系密切。本研究同樣發(fā)現(xiàn)膿毒癥模型組大鼠心肌細胞ICAM-1 蛋白表達明顯增加，證明其與心肌炎性反應(yīng)，中性粒細胞侵潤，心臟功能障礙明顯相關(guān)。

他汀類藥物抗膿毒癥作用機制較為復(fù)雜，同時也是多方面的。大量動物實驗表明膿毒癥時他汀類藥物可以在不同水平、不同機制上發(fā)揮臟器保護作用，抑制炎性反應(yīng)［5］，改善功能障礙，降低膿毒癥模型的死亡率［6］。本實驗主要探討辛伐他汀對膿毒癥模型心肌細胞ICAM-1 表達的影響，結(jié)果顯示:造模后48 h 經(jīng)辛伐他汀預(yù)處理的膿毒癥大鼠心肌細胞ICAM-1 的蛋白表達較膿毒癥組明顯減少(P ＜0.05)，因此理論上可以減少膿毒癥時心肌組織中性粒細胞的浸潤，抑制炎性反應(yīng)，改善心臟功能。關(guān)于辛伐他汀可以減少ICAM-l 表達的機制可能與其抑制心肌細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等上游信號傳導(dǎo)通路有關(guān)［7］，具體機制有待進一步研究。

本實驗主要通過免疫組化的方法研究辛伐他汀預(yù)處理對膿毒癥大鼠心肌組織ICAM-1 表達影響，受研究方法與樣本數(shù)所限，結(jié)果存在一定局限性。并且本實驗結(jié)果雖然證實辛伐他汀預(yù)處理可以抑制ICAM-1 的蛋白表達，但是辛伐他汀組同正常組相比仍有明顯差異，因此20 mg/kg 的辛伐他汀預(yù)處理劑量只是參考相關(guān)文獻進行的探索性實驗，其他劑量與種類的他汀類藥物的實驗效果有待進一步研究。

1 Hubbard WJ，Choudhry M，Schwacha MG，et al.Cecal ligation and puncture.Shock，2005，24:52-57.

2 Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors.Cancer，2000，89:2637-2645.

3 van Griensven M，Probst C，Müller K，et al.Leukocyte-endothelial interactions via ICAM-1 are detrimental in polymicrobial sepsis.Shock，2006，25:254-259.

4 Davani EY，Boyd JH，Dorscheid DR，et al.Cardiac ICAM-1 mediates leukocyte-dependent decreased ventricular contractility in endotoxemic mice.Cardiovasc Res，2006，72:134-142.

5 Chaudhry MZ，Wang JH，Blankson S，et al.Statin(cerivastatin)protects mice against sepsis-related death via reduced proinflammatory cytokines and enhanced bacterial clearance.Surg Infect(Larchmt)，2008，9:183-194.

6 Beffa DC，F(xiàn)ischman AJ，F(xiàn)agan SP，et al.Simvastatin treatment improves survival in a murine model of burn sepsis:Role of interleukin 6.Burns，2011，37:222-226.

7 Madonna R，Di Napoli P，Massaro M，et al.Simvastatin attenuates expression of cytokine-inducible nitric-oxide synthase in embryonic cardiac myoblasts.J Biol Chem，2005，280:13503-13511.