王鵬 王敬 李樂(lè) 霍峰 王笑茹 李春輝

近年來(lái)，舌癌的基礎(chǔ)和臨床研究均取得了很大發(fā)展，深入研究其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，全面揭示其生物學(xué)特性，對(duì)判斷其惡性程度，指導(dǎo)臨床治療和評(píng)估預(yù)后具有重要意義。目前有關(guān)環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，Cox-2)、β 連環(huán)蛋白(β-catenin)和凋亡抑制基因Survivin 蛋白與腫瘤的增殖、抗凋亡等關(guān)系的研究日益受到人們關(guān)注［1－3］。本研究采用RT-PCR 方法檢測(cè)舌癌組織及正常口腔黏膜中Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 及Survivin mRNA 的表達(dá)情況，旨在探討其在舌癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院口腔科2006 至2011 年手術(shù)切除及活檢后經(jīng)病理診斷明確的存檔舌癌標(biāo)本60 例，其中男37 例，女23 例;年齡40 ～75 歲;所有患者手術(shù)前均未經(jīng)放療、化療或免疫治療;所有舌癌病例均經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科資深醫(yī)師組織病理學(xué)證實(shí)，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO 2002 年《頭頸部腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)》，其中高分化19 例(高分化組)，中分化26 例(中分化組)，低分化15 例(低分化組)。收集舌外傷、舌修整正常舌黏膜組織30 例為正常對(duì)照。

1.2 標(biāo)本處理檢測(cè)標(biāo)本置－70℃液氮中保存。

1.3 主要試劑(1)總RNA 提取試劑異硫氰酸胍(Trizol Reagent):美國(guó)Invitrogen Life technologies 公司;(2)反轉(zhuǎn)錄酶(AMV);(3)RNA 酶抑制劑;(4)dNTP 混合液;(5)Oligo(dT)15;(6)γ-Taq DNA 聚合酶;(7)目的基因引物:2 ～7 均購(gòu)自日本TaKaRa 公司;(8)瓊脂糖:購(gòu)自美國(guó)Promaga 公司。

1.4 主要設(shè)備小型臺(tái)式離心機(jī)(SIGMA，1-13)，PCR 擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra)，紫外分光光度計(jì)(UV-visible Spectrometer，UV300)，電泳儀(BIO-RAD，PowerPac200)，Chemi Imager 5500凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(Alphain-notech chemi Imager)。

1.5 方法

1.5.1 總RNA 的提取:TRIZOL 法提取組織總RNA，將－70℃凍存的組織取出，稱(chēng)取100 mg，在EP 管中剪碎，加入TRIZOL試劑1 ml，勻漿后移入EP 管，室溫5 min 后加入0.2 ml 氯仿，振動(dòng)15 s，室溫2 ～3 min。12 000 r/min 離心15 min 后將上清移入新管。每管加0.5 ml 異丙醇，室溫10 min，沉淀RNA，12 000 r/min離心10 min 后，去除上清，加1 ml 75%乙醇。漩渦振蕩后7 500 r/min 離心5 min。干燥RNA，加入DEPC 處理水20 μl。紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260 與OD280，二者比值應(yīng)1.8～2.0，提示樣本中無(wú)蛋白剩余。RNA(μg/μl)濃度=OD260×40×稀釋倍數(shù)/1 000。

1.5.2 引物合成:根據(jù)文獻(xiàn)及GenBank 提供RNA 序列確定引物，Cox-2 正向引物5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3’，反向引物5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTTT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度305 bp。β-catenin 正向引物5’-TGGCCTGGTTTGATACTGACCT-3’，反 向 引 物5’-CTCTACAGGCCAATCACAATGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度383 bp。Survivin 正向引物5’-GATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，反向引物5’-TCAATCCATGGCAGCCAGCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度430 bp。β-actin 正向引物5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，反向引物5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度318 bp。

1.5.3 RT-PCR 反應(yīng):逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用20 μl 體系。Oligo dT 1 μl，細(xì)胞總RNA 0.5 μg，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，DEPC 處理DDW 至13 μl，混合后加熱至75℃，5 min 后移至冰上使其迅速冷卻。快速離心后加入5×buffer 4 pl，加熱至42℃，2 min 后加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，42℃保溫50 min 后，70℃、15 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR 反應(yīng)體系為25 μl(10×buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，目的序列上下游引物各1 μl，cDNA2 μl，Taq 酶0.5 μl)。反應(yīng)條件為95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，共30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.5.4 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)和分析:取5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳30 ～50 min，紫外燈下照相，用凝膠成像處理系統(tǒng)對(duì)每一樣品PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行掃描，以β-actin 密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，目的基因Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 和Survivin mRNA 的表達(dá)量分別以Cox-2、β-catenin 和Survivin 與β-actin 密度之比表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，相關(guān)性用Pearson 相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 和Survivin mRNA 的表達(dá)情況在305 bp 處可見(jiàn)有Cox-2 條帶，382 bp 處可見(jiàn)β-catenin 條帶，430 bp 處可見(jiàn)Survivin 條帶。60 例舌癌中Cox-2、Survivin的表達(dá)明顯增高，而在30 例正常黏膜中未見(jiàn)表達(dá);β-catenin 在正常黏膜和舌癌中均見(jiàn)表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度顯著不同。見(jiàn)圖1 ～3。

圖1 Cox-2 mRNA 在各組中的表達(dá)

圖2 β-catenin mRNA 在各組中的表達(dá)

圖3 Survivin mRNA 在各組中的表達(dá)

2.2 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表達(dá)Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA、Survivin mRNA 表達(dá)隨分化程度的降低而升高，低分化組Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA、Survivin mRNA 表達(dá)顯著高于高、中分化組(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表達(dá)±s

表1 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表達(dá)±s

注:與低分化組比較，*P ＜0.05

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2.3 Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 與Survivin mRNA 的表達(dá)的相關(guān)分析Cox-2 mRNA 與β-catenin mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.856，P ＜0.01);Cox-2 mRNA 與survivin mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.985，P ＜0.01);β-catenin mRNA 與Survivin mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.857，P ＜0.01)。

3 討論

Cox-2 是一種催化致炎性物質(zhì)地諾前列酮合成的重要限速酶，在體內(nèi)呈誘導(dǎo)性表達(dá)，在生理狀態(tài)下多數(shù)組織不表達(dá)Cox-2。當(dāng)受到炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和內(nèi)毒素以及某些有絲分裂原的刺激時(shí)，Cox-2 的表達(dá)水平增強(qiáng)。Cox-2 過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致地諾前列酮的合成增加，進(jìn)而促進(jìn)許多腫瘤的形成。Iniesta等［4］提出通過(guò)檢測(cè)患者血清中Cox-2 的表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞癌進(jìn)行診斷、分期及對(duì)預(yù)后的評(píng)估，既有效又簡(jiǎn)便。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)對(duì)舌癌組織及正常黏膜組織中Cox-2 的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn):在正常組織中未見(jiàn)表達(dá)，Cox-2 在舌癌中的表達(dá)明顯增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cox-2 陽(yáng)性表達(dá)與舌癌組織的分化程度呈負(fù)相關(guān)，低分化舌癌與高中分化舌癌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。舌癌組織中Cox-2 高表達(dá)，可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、增強(qiáng)腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移活性，促進(jìn)VEGF 生成從而促進(jìn)腫瘤血管的形成有關(guān)［5，6］。這提示Cox-2 可能會(huì)是一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)用以判斷舌癌進(jìn)展的惡性程度。

β-catenin 是一種由連環(huán)蛋白基因(CTNNB1)編碼的多功能蛋白質(zhì)。β-catenin 的表達(dá)變異會(huì)關(guān)系到腫瘤中骨架蛋白及調(diào)控作用的改變，從而加速腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變［7］。Fuchs 等［8］的實(shí)驗(yàn)研究中顯示β-catenin 可通過(guò)形成特定復(fù)合物，參與口腔鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)行為過(guò)程。Yasusei 等［9］對(duì)一個(gè)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明，母細(xì)胞的侵襲能力顯著低于無(wú)性繁殖系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了β-catenin 在舌癌組織及正常黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，在正常組織及舌癌組織中β-catenin 均有表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度有明顯差異;比較分析高中分化舌癌與低分化舌癌間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。這表明，β-catenin可能作為舌癌的一個(gè)重要預(yù)后因子用于舌癌的惡性程度的判斷及指導(dǎo)臨床治療工作;β-catenin 還可能是舌癌進(jìn)展的重要調(diào)控因子，其機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞中的Wnt 信號(hào)通路異常和細(xì)胞失去黏附功能導(dǎo)致細(xì)胞分散，癌細(xì)胞表型改變獲得高侵襲性有關(guān)［10］。

Survivin 是IAP(凋亡抑制蛋白)家族的最新成員，位于染色體17q25，全長(zhǎng)15kb。Marusawa 等［11］認(rèn)為Survivin 通過(guò)抑制Caspases-9 的活性來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而不是Caspases-3 和Caspases-7。Lo Muzio 等［12］的實(shí)驗(yàn)研究表明Survivin 在口腔癌病變向侵襲性癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，具有重要評(píng)估意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)Survivin 在舌癌及正常黏膜中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):Survivin 在正常黏膜中未見(jiàn)表達(dá)，而在舌癌中高表達(dá)，且與組織分化程度有一定關(guān)系，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)呈負(fù)相關(guān);這提示Survivin 可能是舌癌的一個(gè)重要調(diào)控指標(biāo)。Survivin 與其他腫瘤指標(biāo)之間是如何相互作用和聯(lián)系的，我們?nèi)孕枰M(jìn)一步研究。

舌癌的發(fā)生發(fā)展是由多個(gè)基因參與、多種因素共同作用的結(jié)果。進(jìn)展過(guò)程中Cox-2、β-catenin 和Survivin 基因之間存在密切關(guān)系，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中可能相互影響。Cox-2 與βcatenin 的表達(dá)相互促進(jìn)，Cox-2/β-catenin 通路上調(diào)Survivin 的表達(dá)，Survivin 又促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。它們之間可能存在特殊的調(diào)控關(guān)系，其具體作用機(jī)制有待于我們進(jìn)一步探討。

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