★ 張倫 劉蔚 戈焰 榮尚一

（1.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095；2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院 廣州 510515）

慢性萎縮性胃炎屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”、“胃痞”等范疇[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病病因不外乎飲食不節(jié)、情志所傷與脾胃虛弱。慢性萎縮性胃炎患者久病脾虛，加之調(diào)養(yǎng)失當(dāng)，外邪侵襲等因素，使中氣更虛不足以行血，漸致壅滯成瘀。脾虛血瘀證是慢性萎縮性胃炎中醫(yī)學(xué)臨床最常見(jiàn)證型，萎胃湯驗(yàn)之臨床屢獲良效，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究萎胃湯可能的作用機(jī)制，為今后更深一步的研究工作打下基礎(chǔ)，現(xiàn)將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重180-220g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2003-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：廣東省中醫(yī)研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（粵）2005-0059，溫度20℃-25℃，濕度60%-70%，SPF級(jí)大鼠飼料，飲用無(wú)菌水。

1.1.2 藥品 試驗(yàn)藥：萎胃湯（黃芪、黨參、當(dāng)歸、白術(shù)、甘草、枳殼、石斛、雞內(nèi)金、山楂、三七、莪術(shù)），由廣東省第二中醫(yī)院中藥房提供，單味顆粒劑由廣東省一方制藥廠生產(chǎn)；對(duì)照藥：胃復(fù)春片（成分為紅參、香茶菜、炒枳殼等），杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z200040003，批號(hào)：090604。

1.2 方法

1.2.1 MNNG飲用液配制 用滅菌自來(lái)水將MNNG配制成10mg/L濃度的儲(chǔ)存液，避光冷藏保存，用時(shí)將其配成1 500 μg/mL的飲用液，裝入200mL的飲水瓶中，外貼黑色避光紙，整個(gè)配制過(guò)程全部避光操作。

1.2.2 劑量設(shè)置 以藥品說(shuō)明書標(biāo)示臨床日用量作為基礎(chǔ)，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中的劑量換算方法“體表面積比”換算動(dòng)物試驗(yàn)劑量作為臨床等效劑量。換算后，胃復(fù)春片為0.54g/kg（2倍臨床等效劑量），萎胃湯高劑量為20.8 g生藥/kg、中劑量為10.4 g生藥/kg、低劑量為5.2 g生藥/kg（分別為4倍臨床等效劑量、2倍臨床等效劑量、臨床等效劑量）。

1.2.3 動(dòng)物造模 取SPF級(jí)SD大鼠70只，雌雄各半，常規(guī)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取雌雄各5只作為空白對(duì)照組，其余大鼠采用1 500 μg/mL的MNNG飲水加饑飽失常的方法復(fù)制CAG模型[2-3]，連續(xù)3個(gè)月。具體操作如下。

（1）MNNG溶液自由飲用：濃度為1 500 μg/mL的MNNG溶液，裝入外涂黑色的飲水瓶中，每天更換并給足量，自由飲用。

（2）饑飽失常：2d足量喂食，1d停食，循環(huán)實(shí)施。

3個(gè)月后，隨機(jī)抽取5只動(dòng)物，脫頸椎處死動(dòng)物，迅速取胃。經(jīng)病理組織學(xué)檢查，判斷動(dòng)物造模情況。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥（新藥）臨床研究指導(dǎo)原則》（2002）中GAG的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理確診：①固有腺體萎縮；②黏膜肌層增厚；③可有腸上皮化生或假幽門腺上皮化生；④固有膜炎癥；⑤可有淋巴濾泡形成。

CAG動(dòng)物模型復(fù)制成功后，稱重，10只/組，將造模動(dòng)物按體重隨機(jī)均分為模型組、胃復(fù)春組（0.54g/kg）、萎胃湯高（20.8 g生藥/kg）、中（10.4 g生藥/kg）、低（5.2 g生藥/kg）劑量組（分別為4、2、1倍臨床等效劑量）。

1.2.4 給藥方法 各組大鼠按劑量灌胃給藥，10mL/kg，1次/d，空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水。連續(xù)12周。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè)與標(biāo)本采集 測(cè)定胃酸、血清SOD活性、MDA、胃泌素含量。

胃酸測(cè)定：于末次給藥后，大鼠禁食24 h，禁水8 h，眼眶采血；用25%烏拉坦腹腔注射麻醉，剖腹，結(jié)扎幽門、賁門，取出全胃，沿胃大彎剖開(kāi)胃腔，傾出內(nèi)容物，用5.0 mL生理鹽水沖洗，收集于沖洗液于離心管中，3 000 rpm離心20 min，吸取上清液1.0 mL，用PH計(jì)測(cè)量pH值，計(jì)算原胃液PH值；二步滴定法[4]測(cè)胃液總酸度。將血液于3 000rmp離心10min，吸取血清。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定血清中的SOD活性、胃泌素、MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料多組間均數(shù)的比較先采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間的均數(shù)兩兩比較用SNK法；方差不齊時(shí)，以平均秩次、下四分位數(shù)、中位數(shù)和上四分位數(shù)（P25，P50，P75）表示，多組間平均秩次比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，組間平均秩次的兩兩比較用Mann-Whitney U法。以上數(shù)據(jù)均由SPSS15.0完成，α=0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 一般情況

CAG模型大鼠精神萎靡、眼睛無(wú)神、活動(dòng)緩慢，毛發(fā)色澤枯稿、疏松粗糙、豎毛、易脫落，食量減少，常有便溏、形體偏小，耳色淡白，拱背，喜扎堆，消瘦、體重增加緩慢。治療期間，空白組未發(fā)現(xiàn)上述表現(xiàn)，各治療組大鼠經(jīng)治療后，其毛色、精神狀態(tài)、食欲、大便、活動(dòng)情況等均有不同程度的改善，而以萎胃湯高、中劑量組最好、萎胃湯低劑量組和胃復(fù)春組次之，模型組最差。

2.2 對(duì)CAG大鼠胃液PH值、胃泌素的影響

與空白對(duì)照組比較，各組大鼠胃液PH顯著升高（均P＜0.01）；與模型組相比，胃復(fù)春組、萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組大鼠胃液PH均顯著性降低（P＜0.01）；與胃復(fù)春組相比，萎胃湯高、中劑量組大鼠胃液PH有顯著性降低（均P＜0.01），萎胃湯低劑量組大鼠胃液PH降低不明顯（P＞0.05）。

與空白對(duì)照組相比較，模型組大鼠胃液總酸度和血清胃泌素含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組和胃復(fù)春組大鼠胃液總酸度和血清胃泌素含量顯著升高（均P＜0.01）；與胃復(fù)春組相比，萎胃湯低劑量組大鼠胃液胃液總酸度無(wú)顯著性差異（P＞0.05），萎胃湯低劑量組大鼠血清胃泌素含量有顯著性升高（P＜0.01），萎胃湯高、中劑量組大鼠胃液胃液總酸度和血清胃泌素含量均顯著性升高（均P＜0.01）。

表1 萎胃湯對(duì)CAG大鼠PH值、總酸度、胃泌素含量的影響（±s）

表1 萎胃湯對(duì)CAG大鼠PH值、總酸度、胃泌素含量的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組#P＜0.05，##P＜0.01；與胃復(fù)春組比較，§P＜0.05，§§P＜0.01.

分組血清胃泌素/pg?mL-1 145.58±7.38##§§73.89±8.71**§§95.17±7.21**##129.85±5.27##§§120.53±13.18**##§§112.89±7.17**##§§空白組模型組胃復(fù)春組高劑量組中劑量組低劑量組胃液pH值2.11±0.52##§§5.17±0.52**§§4.48±0.45**##2.99±0.49**##§§3.43±0.43**##§§4.27±0.57**##總酸度/mmol?L-1 150.60±14.87##§§75.45±4.53**§§95.86±3.84**##132.56±12.92**##§§120.64±10.84**##§§105.45±8.90**##

2.3 對(duì)大鼠血清SOD（超氧化物歧化酶）活性和MDA（丙二醛）含量的影響

與空白對(duì)照組相比較，模型組CAG大鼠血清SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比較，胃復(fù)春組和萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組SOD活性顯著升高（均P＜0.01）；與胃復(fù)春組相比較，萎胃湯高劑量組SOD活性顯著升高（P＜0.01），萎胃湯中、低劑量組SOD活性亦有升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

與空白對(duì)照組相比較，模型組CAG大鼠MDA顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比較，胃復(fù)春組和萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組MDA顯著降低（均P＜0.01）；與胃復(fù)春組相比較，萎胃湯高劑量組MDA顯著降低（P＜0.01），萎胃湯中、低劑量組MDA亦有降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 萎胃湯對(duì)CAG大鼠血清SOD和MDA的影響（±s）

表2 萎胃湯對(duì)CAG大鼠血清SOD和MDA的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組#P＜0.05，##P＜0.01；與胃復(fù)春組比較，§P＜0.05，§§P＜0.01.

MDA/mmol?L-1 9.48±2.06##§§16.88±1.06**§§14.29±0.98**##10.96±1.61*##§§12.96±1.83**##13.58±1.50**##分組空白組模型組胃復(fù)春組高劑量組中劑量組低劑量組SOD/U?mL-1 152.61±10.37##§§97.84±9.95**§§132.93±11.49**##150.13±12.84##§§137.14±9.12**##137.53±6.68**##

2.4 不良事件發(fā)生率

2組大鼠于灌藥期間均無(wú)出現(xiàn)死亡、消化道出血、血尿等的不良事件，提示萎胃湯為安全的藥物。

3 討論

本研究采用以MNNG為主的加饑飽失常法復(fù)制CAG大鼠模型。造模開(kāi)始后6周大鼠即開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)量、飲食量、體重、毛色、二便等方面的異常變化，至12周時(shí)上述改變更加明顯，而且胃粘膜肉眼觀和顯微鏡鏡下觀呈不同程度的萎縮、胃壁厚變薄、彈性降低、皺壁減少、黏膜色澤發(fā)白或變暗，有出血點(diǎn)等情況的發(fā)生，符合人類CAG的臨床和病理特征。

近年來(lái)，超氧化物歧化酶（SOD）的防御和修復(fù)氧代謝產(chǎn)物的損傷作用得到了廣泛的重視，測(cè)定SOD可在一定程度上反映機(jī)體清除自由基能力的大小。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，可與脂質(zhì)過(guò)氧化中間產(chǎn)物自由基損傷膜結(jié)構(gòu)，改變膜成分的活性及抗原性而影響膜的正常功能。因此，MDA水平是脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷效應(yīng)的特征性指標(biāo)。蔣時(shí)紅等[5]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠模型血清和胃黏膜SOD水平明顯下降，而MDA水平明顯升高，表明CAG大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，超出了抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力，使MDA增高，自由基代謝異常起著重要作用。

胃泌素主要由胃竇G細(xì)胞釋放，除存在于血液和組織中，也存在于胃液內(nèi)，具有刺激胃酸分泌，促使胃腸粘膜的蛋白質(zhì)、RNA、DNA的合成，促使胃腸粘膜的生長(zhǎng)與更新速度加快等作用。還能引起幽門括約肌松弛，胃竇肌收縮，加快胃排空。在CAG時(shí)由于腺體萎縮，腸上皮化生，G細(xì)胞數(shù)量減少，GAS分泌下降，由于失去了激素的營(yíng)養(yǎng)作用，胃粘膜進(jìn)一步萎縮，腸化加劇，形成惡性循環(huán)。因此，檢測(cè)胃酸、胃蛋白酶活性及血清胃泌素含量對(duì)于CAG的診斷及藥物療效的判定，具有非常重要的意義。

本研究提示萎胃湯各劑量組均能改善CAG模型大鼠的生存質(zhì)量：即大鼠的精神狀況、飲食量、活動(dòng)度、體重、毛色、二便等一般情況，且萎胃湯高、中劑量組較對(duì)照藥胃復(fù)春為好。在改善胃液PH方面，萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組大鼠均顯著性降低胃液PH值（P＜0.01），且萎胃湯高、中劑量組較胃復(fù)春組大鼠胃液PH值亦有顯著性降低（均P＜0.01）。在胃酸分泌功能方面，萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組和胃復(fù)春組均升高了胃泌素的分泌情況（均有P＜0.01），且萎胃湯高、中劑量組較胃復(fù)春組大鼠胃泌素亦有顯著性升高（均P＜0.01）。在抗氧化能力方面亦有改善，萎胃湯3個(gè)劑量組均顯著升高了SOD活性（均P＜0.01），降低MDA的含量（均P＜0.01）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究也可以看出，治療作用中以萎胃湯高劑量效果最好；治療劑量呈現(xiàn)了一定的劑量正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步闡明了萎胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制。

[1]白兆芝，張彥敏，張潤(rùn)順，等.胃安泰膠囊治療慢性萎縮性胃炎癌前病變的臨床研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（2）：16-17.

[2]陳云逸.胃癌動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2006，19（1）：751.

[3]雪輝，王建國(guó).大鼠慢性萎縮性胃炎模型的建立[J].張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，19（2）：11.

[4]陳奇.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：859.

[5]蔣時(shí)紅，劉旺根，王雪萍，等.黃芪建中湯對(duì)脾虛型慢性萎縮性胃炎大鼠血象、血液和胃黏膜生化指標(biāo)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12（4）：279-281.