陳振勇， 代紅梅， 涂志剛， 楊 鵬， 蔣春舫， 馮賢松

盡管隨著術前評估和術后護理的進展，阻塞性黃疸(阻黃)(obstructive jaundice，OJ)仍保持較高的發(fā)病率和死亡率，其中關鍵性的病理生理因素是腸道屏障功能破壞［1］，腸通透性增加［2］。其中尚有許多未解之處。術后胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指繼發(fā)于大手術后的機體對胰島素敏感性下降，組織利用葡萄糖障礙的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在術后血糖升高，糖耐量異常。嚴重的術后IR會產(chǎn)生多種負面影響，影響機體代謝，破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，加重組織蛋白分解。臨床研究顯示術后IR在擇期腹部手術中普遍存在，發(fā)生的機制并未完全闡明［3］。而擇期腹部大手術后均存在腸黏膜屏障的破壞［4］，我們前期的實驗研究亦發(fā)現(xiàn)阻黃能破壞腸緊密連接蛋白，損傷腸黏膜屏障，引起內(nèi)毒素血癥和腸細菌移位。既然這兩者在術后均普遍存在，那么兩者間是否具有某種聯(lián)系?我們在前期實驗的基礎上，以阻黃大鼠為模型，研究兩者間的相關性。

材料和方法

1 動物與分組

50只5周齡Wistar大鼠，雌雄不限，體重(300±20)g，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部，單籠適應性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法平均分為5組，每組10只。采用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉。手術過程中預防性給予0.1 mL/g體重的生理鹽水皮下注射。對照組:即假手術組，麻醉后僅行開關腹手術;阻黃組(OJ組):取上腹正中切口，顯露肝十二指腸韌帶，于近肝門處游離并結(jié)扎膽總管;胰高血糖素樣肽2(glucagon-like peptide 2，GLP-2)組:阻黃動物腹腔注射GLP-2(美國多肽公司)0.5 mL(250 mg·kg－1·d－1)，連續(xù) 7 d;胰島素組(insulin組):阻黃動物頸背部皮下注射胰島素(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司)0.45 U/kg;連續(xù)7 d。

2 檢測指標

2.1 術后IR的檢測 手術前1 d(1 d before operation，1 d BO)、手術后 2、24、48 h 和 3、7 d 空腹大鼠尾靜脈各采血300 μL。美國雅培公司血糖儀檢測大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG，mmol/L)，放射免疫法(北方生物技術研究所)測定空腹血清胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS，mU/L)。使用穩(wěn)態(tài)模式評估法(homeostasis model assessment，HOMA)計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。各時點相隔5min采血3次取平均值。

2.2 乳果糖/甘露醇(lactulose/mannitol，L/M)比值檢測 實驗動物分別于各時點采血后自由飲水，經(jīng)胃管每只喂服2 mL檢測溶液(含10%乳果糖100 mg和5%甘露醇50 mg，Sigma)。隨后連續(xù)收集6 h尿液，混勻后取5 mL，加入1 mg硫柳汞作防腐劑，置于－20℃冰箱保存。利用色譜儀分析尿中L/M比值。每只大鼠尿標本分3次各取5 mL，重復測量3次。

2.3 血清類抵抗素分子β(resistin-like molecule beta，RELMβ)濃度的測定 采用RELMβ ELISA試劑盒(上海天呈生物科技有限公司)，100 μL血清標本加入96孔板，按說明書操作，通過多波段培養(yǎng)皿閱讀器在420 nm處測量每孔吸光度。測量極限75 ng/L。

2.4 回腸組織內(nèi)RELMβ mRNA的檢測 采取半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(武漢博士德公司)檢測組織細胞內(nèi)RELMβ表達。各組動物分別于術后第8 d拉脫法處死。無菌取原手術切口，距回盲部10 cm處環(huán)形切取回腸，取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模版進行PCR擴增。擴增片段及引物［5］:上游引物5’-CCC TTC TCC AGC TGA TCA AC-3’，下游引物 5’-CCA CGA ACC ACA GCC ATA G-3’;以β-actin作為內(nèi)參照，上游引物5’-TTG CCT CTC AGA CAA TGC CTG-3’，下游引物5’-TCG CTC CTG GAA GAT GGT GAT-3’。循環(huán)條件:94℃預變性5 min;94℃ 30 s，58℃ 1 min;72℃ 1 min;共35個循環(huán)，最后72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物通過12%瓊脂糖凝膠電泳，并用密度掃描分析PCR產(chǎn)物帶。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0分析，組間計量資料比較，方差齊時采用單因素方差分析及配對資料t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 阻黃術后IR指數(shù)的變化

阻黃和對照組動物術后IR指數(shù)均明顯升高，與術前相比，對照組術后48 h IR指數(shù)達到最高(8.8±1.9)，阻黃組術后 3 d 為最高(10.1 ±1.8)，均明顯高于其它時點(均P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The changes of index of IR after operation.BO:before operation.Mean ±SD.n=10.#P ＜0.05 vs other time points in control group;△P ＜0.05 vs other time points in OJ group.圖1 阻黃術后IR指數(shù)的變化

2 阻黃術后L/M的變化

L/M比值是反映腸黏膜通透性的指標。對照組術后有所上升，但各時點的上升幅度沒有統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，阻黃組術后明顯上升，其中3 d組達到最高值 0.66 ±0.08(P ＜0.05)，7 d 組開始下降，但仍高于其它時點，見圖2。

Figure 2.The changes of ratio of L/M after operation.Mean ±SD.n=10.#P ＜ 0.05 vs other time points in OJ group.圖2 阻黃術后L/M的變化

3 IR與L/M比值變化間的相關性

將術后IR與L/M比值的變化進行相關性分析，結(jié)果兩者的相關系數(shù)r=0.86(P＜0.05)，呈明顯正相關。

4 GLP-2組術后IR的變化

GLP-2是一種腸黏膜保護劑［6］，能恢復受損的腸黏膜。腹腔注射GLP-2后術后IR指數(shù)較阻黃組下降，其中7 d組從7.33 ±1.07 降至4.62 ±0.53，降幅達37.0%，為各時點最大降幅(P ＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The changes of index of IR after operation in GLP－2 group.Mean ±SD.n=10.#P ＜0.05 vs OJ group.圖3 GLP-2組術后IR的變化

5 胰島素組術后L/M的變化

研究顯示圍手術期強化胰島素治療可以降低術后IR［7］。使用胰島素后L/M在3 d和7 d較阻黃組明顯降低，其中3 d組從0.66±0.08降至阻黃組的0.35 ±0.04，降幅最大達46.7%(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The changes of ratio of L/M in insulin and OJ groups.Mean±SD.n=10.#P ＜0.05 vs other time points in OJ group.圖4 胰島素組和阻黃組術后L/M的變化

6 術后IR與腸黏膜屏障間的聯(lián)系

用ELISA檢測阻黃組不同時點血清RELMβ的含量，結(jié)果阻黃動物術后3 d RELMβ血清含量達到最高［(0.69 ±0.05)μg/L］，見圖 5A，分別與術后IR指數(shù)變化的相關度r=0.955(P＜0.05)，與L/M變化的相關系數(shù)r=0.736(P＜0.05)。由于RELMβ在腸道組織內(nèi)特異性表達，我們進一步研究末端回腸上皮細胞內(nèi)RELMβ mRNA的表達。半定量PCR顯示各組相對RELMβ mRNA水平均高于對照組，與血清濃度不同的是 GLP-2組上皮組織內(nèi) RELMβ mRNA相對含量高于胰島素組，見圖5B。

7 各組血清RELMβ含量

由于GLP-2和胰島素可以分別影響腸黏膜屏障和IR，我們研究兩者對血清RELMβ含量的影響，結(jié)果各組均高于對照組(P＜0.01)，其中阻黃組最高達(0.41 ±0.04)μg/L，GLP-2 組與胰島素組相比差異無統(tǒng)計學意義，見圖6。

討 論

術后IR在腹部手術后普遍存在［2］，發(fā)生機制十分復雜，一般認為與抗調(diào)節(jié)激素(如生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺)、細胞因子(IL-1、IL-6和 TNF-α)的大量釋放及外周組織胰島素抵抗密切相關。而外周組織胰島素抵抗又與胰島素受體有關，并可初步區(qū)分為受體前、受體和受體后機制［8］。

臨床和實驗均觀察到腹部大手術后存在腸黏膜屏障的破壞［4］，我們前期以阻黃動物模型為實驗對象，研究發(fā)現(xiàn)阻黃手術后腸緊密連接蛋白數(shù)量和分布受損，緊密連接通道開放，腸黏膜屏障通透性增加，出現(xiàn)腸細菌移位和內(nèi)毒素血癥。既然這兩者在術后均普遍存在，那么兩者間是否具有某種聯(lián)系?

Figure 5.The changes of serum RELMβ concentration detected by ELISA(A)and the expression of RELMβ mRNA detected by RT-PCR(B).1:control;2:OJ;3:insulin;4:GLP －2.Mean ±SD.n=10.#P ＜0.05 vs insulin group;*P ＜0.05 vs control group.圖5 血清RELM β的含量和組織內(nèi)RELMβ mRNA表達

Figure 6.Serum RELMβ concentration.Mean±SD.n=10.#P ＜0.05 vs control group.圖6 各組血清RELMβ含量

我們的研究發(fā)現(xiàn)阻黃術后IR和腸黏膜屏障的破壞間具有明顯相關。阻黃術后IR指數(shù)增加，阻黃組和假手術組術后IR指數(shù)均遠高于術前，說明手術后均存在IR。阻黃組術后3 d IR指數(shù)達到最高(10.1±1.8)，且反映腸黏膜通透性的指標L/M比值也在術后3 d達到最高(0.66±0.08)，兩者的相關系數(shù)r=0.86，說明兩者間的變化具有同步性。

既然兩者有相關性，那么改變其中一個因素是否也能影響另外一個因素?GLP-2能保護并恢復受損的腸黏膜屏障。結(jié)果阻黃動物使用GLP-2后術后IR指數(shù)較未用者下降。同樣，注射胰島素后，阻黃動物3 d組的L/M降幅最大46.7%。說明兩者間可以互相影響。

由于腸黏膜屏障的產(chǎn)生基礎是腸黏膜上皮細胞及其相互間的緊密連接，因此我們的研究顯示腸道上皮細胞既是術后IR產(chǎn)生的來源，也是IR作用的靶器官。在應激狀態(tài)下，腸上皮細胞分泌抗調(diào)節(jié)激素，參與術后IR形成，同時增高的激素水平反過來也損傷腸上皮細胞，破壞腸黏膜屏障。因此使用腸黏膜屏障保護劑GLP-2，減少了腸上皮分泌抗調(diào)節(jié)激素和細胞因子，達到降低IR的作用。而術后強化胰島素治療，可以降低術后IR，也間接保護了腸黏膜屏障。

那兩者間有什么內(nèi)在聯(lián)系?或者說其交匯點是什么?Steppan等［9］于2001年首次提出抵抗素(resistin)為肥胖與糖尿病的聯(lián)系所在，出現(xiàn)IR的小鼠抵抗素顯著增高。抵抗素參與2型糖尿病的發(fā)病機制，并且2型糖尿病患者中，IR組的抵抗素水平要明顯高于胰島素敏感組［10］。隨后一系列的研究發(fā)現(xiàn)該家族的其它成員，包括類抵抗素分子RELMα、β、γ和resistin［11］。這些家族成員由105～114個氨基酸組成，有3個結(jié)構(gòu)區(qū)域:N端信號肽、中間可變區(qū)和相對保守的富含11個半胱氨酸的C端序列［12］。其中RELMβ也稱作腸道特異性抵抗素，高度局限于腸杯狀細胞［13］，參與維持胃腸道屏障功能［14］，與腸道上皮細胞分化、細胞增殖、免疫反應和炎癥反應密切相關［15］。

用ELISA檢測阻黃組不同時段血清RELMβ的含量，結(jié)果阻黃動物術后3 d組RELMβ血清含量達到最高(0.69±0.05)μg/L，分別與術后 IR 指數(shù)變化呈正相關，說明血清RELMβ含量與術后IR的變化有關。通過RT-PCR研究末端回腸上皮細胞內(nèi)RELMβ的表達，顯示各時點組織細胞內(nèi)相對RELMβ mRNA水平均高于對照組，說明阻黃術后短期內(nèi)血液和組織細胞內(nèi)RELMβ水平上升，與術后IR有一致性。同時阻黃術后使用GLP-2和強化胰島素治療，RELMβ相對含量均上升較多，從另一個角度更加反映RELMβ與術后腸黏膜屏障和IR有關。說明改善腸黏膜屏障和術后強化胰島素治療可以提升血清和組織內(nèi)RELMβ含量，其變化與術后腸黏膜屏障和IR具有一致性。

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