潘坤穎， 劉千萍， 周 欣， 姜鐵民， 李玉明， 張 梅△

無復(fù)流(no-reflow)是指心外膜冠脈閉塞減輕或解除后，缺血心肌組織并未恢復(fù)有效再灌注，微循環(huán)血流仍不能完全恢復(fù)正常的現(xiàn)象。目前，其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，損傷區(qū)大量中性粒細(xì)胞聚集在無復(fù)流延展中起重要作用［1］。生長(zhǎng)分化因子 15(growth differentiation factor 15，GDF-15)是應(yīng)激反應(yīng)性因子，在正常心肌組織幾乎不表達(dá)，具有抗凋亡、抗肥大、抑制單核巨噬細(xì)胞活化等心肌保護(hù)作用［2-3］。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物模型模擬臨床急性心肌梗塞后經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)再通治療，研究無復(fù)流現(xiàn)象中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況和GDF-15的動(dòng)態(tài)表達(dá)。

材料和方法

1 動(dòng)物分組及材料

雄性Wistar大鼠144只(中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250～280 g)，隨機(jī)分為I/R組和sham組各72只。I/R組采用開胸冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎方法，缺血60 min后分別再灌注 2 h、4 h、6 h、12 h、24 h 和 7 d，建立心肌缺血/再灌注損傷模型［4-5］，每個(gè)時(shí)點(diǎn)12只，其中6只隨機(jī)進(jìn)行染色，其余6只用于分子生物水平檢測(cè)。Sham組只穿線不結(jié)扎。術(shù)后大鼠給予自由飲食，于不同時(shí)點(diǎn)取材:檢測(cè)心肌組織中GDF-15 mRNA及蛋白表達(dá)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性;取心室心肌進(jìn)行石蠟包埋切片，HE染色大體評(píng)估心肌損傷情況;硫磺素S(thioflavin S，Sigma)、酞菁藍(lán)(phthalocyanine blue，鄭州勤實(shí)染料公司)和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)等。

2 方法

2.1 模型制備 0.4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，氣管插管，接呼吸機(jī)、心電圖。采用胸外結(jié)扎法，Y形線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，誘導(dǎo)缺血1 h后，剪斷結(jié)扎線，完成再灌注［2］。缺血時(shí)，心肌局部變暗，活動(dòng)減弱，心電圖ST-T呈明顯上抬。再灌注時(shí)，心肌局部搏動(dòng)恢復(fù)，心電圖有不同程度的壞死性Q波及ST段回落［3］。

2.2 基因水平檢測(cè) 再灌注不同時(shí)間取材，迅速分離并取梗死及梗死周邊區(qū)心肌組織，行RNA提取，方法按照Trizol試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。Real-time PCR法檢測(cè)GDF-15 mRNA的表達(dá)。引物序列 GDF-15 上游引物 5’-GACCTAGGTTGGAGCGACTG-3’，下 游 引 物 5’-TAAGAACCACCGGGGTGTAG-3’。β-actin 上游引物 5’-TACCACATCCAAGGAAGGCAGCA-3’，下 游 引 物 5’-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，復(fù)孔3個(gè)。以公式2－ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參照基因的表達(dá)量。

2.3 MPO活性檢測(cè) 取梗死及梗死周邊區(qū)心肌組織置于勻漿器內(nèi)，剪碎，制備勻漿，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，取上清液置管封存冷凍。測(cè)定方法按大鼠MPO試劑盒(上海江萊生物公司)說明進(jìn)行，單位:U/g濕片。

2.4 無復(fù)流面積 再灌注不同時(shí)間后，自右頸總動(dòng)脈逆向注入1%硫磺素S 0.5 mL，再次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，再經(jīng)右頸總動(dòng)脈注入2%酞菁藍(lán)溶液0.8 mL，染色均勻后取出心臟，自結(jié)扎線以下，水平切成約2 mm的薄片，熒光顯微鏡下觀察無復(fù)流區(qū)域并采集圖像，然后將缺血心肌片用0.5%TTC(pH=7.4)溶液避光孵育(37℃)15 min，采集圖像，IPP軟件分析并計(jì)算無復(fù)流和梗死心肌面積。

2.5 免疫組化染色 大鼠心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)20 min，3%的過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化酶，經(jīng)0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液洗滌后分別加入GDF-15Ⅰ抗(按1∶300稀釋)，后續(xù)步驟按ABC法染色試劑盒操作說明進(jìn)行，DAB顯色。目的切片再經(jīng)蘇木素復(fù)染，脫水、透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織中細(xì)胞著色情況。每只大鼠心肌取10張切片，采用二級(jí)計(jì)分法計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量計(jì)分+細(xì)胞著色程度計(jì)分，算出總分后取均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 HE染色 心肌切片經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成5 μm厚石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織損傷及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行分析，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，有顯著差異者用SNK(Student-Newman-Keuls)q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 GDF-15 mRNA及蛋白在損傷心肌組織中的表達(dá)

各時(shí)點(diǎn)之間，I/R組較sham組GDF-15 mRNA表達(dá)量均顯著增高，在再灌注2～24 h之間一直保持幾乎線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，在再灌注24 h時(shí)達(dá)到峰值，見圖1。在組織蛋白水平，I/R組各時(shí)點(diǎn)的GDF-15蛋白表達(dá)量也均顯著高于sham組。I/R組在再灌注后2～6 h時(shí)，GDF-15蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯快速上調(diào)，之后趨勢(shì)稍緩，再灌注24 h時(shí)達(dá)峰值，I/R組再灌注7 d時(shí)依然維持較高表達(dá)，見圖2。

Figure 1.Up-regulation of GDF-15 mRNA in rat myocardial tissues after cardiac I/R.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group at each time point.圖1 大鼠心臟I/R后心肌組織GDF－15 mRNA的表達(dá)上調(diào)

Figure 2.Immunohistochemical analyses of GDF-15 protein expression in rat myocardial tissues after cardiac I/R(× 200).Mean ± SD.n=6.＊＊ P ＜ 0.01 vs sham group at each time point.圖2 免疫組化分析大鼠心臟I/R后心肌組織GDF-15蛋白的表達(dá)

2 心肌組織MPO活性的檢測(cè)

I/R組各時(shí)點(diǎn)之間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，且各時(shí)點(diǎn)MPO活性較sham組均有顯著升高，見圖3。

3 大鼠心肌染色結(jié)果

I/R組缺血面積各時(shí)點(diǎn)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見圖4。Sham組各時(shí)點(diǎn)無缺血、梗死、無復(fù)流發(fā)生。I/R組，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)梗死面積逐漸增大，但在再灌注前3個(gè)時(shí)點(diǎn)變化明顯。無復(fù)流面積也是在再灌注前3個(gè)時(shí)點(diǎn)內(nèi)表現(xiàn)為較明顯的擴(kuò)大延展趨勢(shì)，在延展進(jìn)程中，擴(kuò)展速度在再灌注6 h后幾乎進(jìn)入平臺(tái)期，提示在再灌注6 h之內(nèi)可能是減少無復(fù)流發(fā)生及梗死的關(guān)鍵，見圖5。

Figure 3.MPO activity in rat myocardial tissues after cardiac I/R determined by ELISA kit.Mean ± SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group at each time point.圖3 ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠心臟I/R后心肌組織中MPO的活性

Figure 4.Risk area of the rat hearts after I/R in I/R group.VWA:ventricular wall area.Mean ± SD.n=6.圖4 I/R組大鼠心臟I/R后心肌缺血面積

4 MPO活性與GDF-15蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

由于中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)主要在炎癥損傷發(fā)生后的24～48 h之間明顯，故取I/R組前5個(gè)時(shí)點(diǎn)觀察，以各時(shí)點(diǎn)內(nèi)GDF-15蛋白表達(dá)的陽(yáng)性積分均值ˉx為變量x，以各時(shí)點(diǎn)內(nèi)MPO活性值的均值ˉy為變量y繪制散點(diǎn)圖。隨著GDF－15表達(dá)增高，MPO活性也隨之降低，即中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)量也趨于減少。MPO活性與 GDF-15表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.9895，P＜0.01)，提示GDF-15可能參與抑制無復(fù)流的發(fā)生和延展過程。

5 HE染色結(jié)果

I/R組心肌微血管內(nèi)彌漫分布著中性粒細(xì)胞，周圍局部可見大片心肌凋亡壞死，其中以再灌注2 h、4 h和6 h時(shí)較明顯。在再灌注24 h后，心肌細(xì)胞大片死亡，組織間隙明顯。Sham組只在穿線部位可見輕微損傷，見圖6。

討 論

Figure 5.No-reflow and infarct areas of the rat hearts after I/R in I/R group(thioflavin S，phthalocyanine blue and triphenyltetrazolium chloride staining).In the left figures of the upper panel，fluorescence area:flow area;no fluorescence area:no-reflow area.In the right figures of the upper panel，blue:non-ischemic area;brick red:ischemic area;pale:infarct area.Mean ±SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs R2h.圖5 I/R組大鼠心臟I/R后心肌無復(fù)流面積和梗死面積

Figure 6.Pathological changes of rat myocardial tissues(HE staining，×200).圖6 大鼠心肌組織的病理學(xué)變化

PCI是急性心肌梗死最主要的再灌注手段，能顯著改善這類患者的近遠(yuǎn)期預(yù)后。然而，在ST段抬高型急性心肌梗死患者行PCI術(shù)后，無復(fù)流的發(fā)生率高達(dá)約5%～50%，且與惡性心律失常、心衰、心源性猝死密切相關(guān)［6］。無復(fù)流的發(fā)生機(jī)制眾多，其中，中性粒細(xì)胞激活、浸潤(rùn)、脫顆?？赡苁切募∪毖俟嘧p傷眾多機(jī)制的共同效應(yīng)環(huán)節(jié)或途徑［7］。

GDF-15在無復(fù)流現(xiàn)象中的作用目前還未見研究報(bào)道。既往研究結(jié)果顯示:在小鼠心肌I/R模型中，心肌組織GDF-15可以通過PI3K/Akt1通路發(fā)揮直接抗心肌細(xì)胞凋亡作用［3］。最新研究還發(fā)現(xiàn)GDF-15可以顯著抑制中性粒細(xì)胞表面β2-整合素的活化從而減少中性粒細(xì)胞募集［8］。

本研究結(jié)果顯示，大鼠心肌急性缺血/再灌注后出現(xiàn)明顯的無復(fù)流現(xiàn)象，I/R組心肌梗死及梗死周邊區(qū)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)量和GDF-15的表達(dá)較sham組均明顯升高。這提示在無復(fù)流延展進(jìn)程中，有明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)伴有GDF-15的反應(yīng)性高表達(dá)。在再灌注2～24 h之間，二者不僅有明顯的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，且存在負(fù)相關(guān)，提示在大鼠急性心肌缺血再灌后無復(fù)流面積的延展中，GDF-15可能能抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而抑制無復(fù)流。

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