陳 東， 趙 鵬， 殷曉煜， 陳 偉， 肖偉鍇， 梁力建△

索拉非尼(sorafenib;商品名:多吉美)是一個多靶點的分子靶向藥物，對受體輔助因子1(receptor accessory factor，Raf-1)激酶、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor，VEGFR)2、VEGFR3、Fms樣酪氨酸激酶(Fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT)3、Ret、C-kit、血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)等靶點有抑制作用。目前已有多項國際多中心研究證明索拉非尼對晚期原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)有明顯、確切的療效，能明顯延長晚期肝癌的生存時間［1-4］。目前，索拉非尼已作為晚期、不可切除肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療而廣泛應(yīng)用。Liu等［5］利用細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)索拉非尼可抑制Raf，下調(diào)絲裂原激活蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK，又稱MEK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)表達(dá)，即通過抑制Raf/MEK/ERK(MAPK)信號通路的表達(dá)來抑制HCC細(xì)胞的增殖。另外，絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路也是VEGFR2、VEGFR3、PDGFR等靶點的下游信號通路，但索拉非尼抑制MAPK信號通路的具體分子機制目前仍不明確。本研究進(jìn)行完善的實驗設(shè)計，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和CCK-8(cell counting kit-8)實驗，篩選出對索拉非尼敏感的肝癌細(xì)胞株，利用MAPK信號通路PCR基因芯片，檢測索拉非尼作用后MAPK信號通路中具體分子的基因表達(dá)變化，確定了索拉非尼作用HCC過程中MAPK信號通路中發(fā)生變化的具體作用分子。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 Huh7、HepG2、SMCC7721和 PLC 細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，HepG2.2.15細(xì)胞購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，MHCC-97H細(xì)胞購自上海中山醫(yī)院肝癌研究所。

1.2 基因芯片 人 MAPK PCR Array(PAHS-061，Qiangen)。

1.3 儀器與試劑 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(QUEUE)，流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)，紫外吸收分光光度計(NanaDrop? ND-1000)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，二甲基亞砜(DMSO，上海生物試劑廠)，EDTA(華美生物工程公司);青/鏈霉素雙抗(penicillin-streptomycin，P/S，上海新先鋒藥業(yè)有限公司)，CCK-8試劑盒(Sigma)，sorafenib(德國拜耳醫(yī)藥公司)，Annexin-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒(Becton＆Dickinson)，Trizol試劑(Invitrogen)，RNeasy? MinEluteTM純化試劑盒(Qiagen)，2× SuperArray PCR master Mix(Cat.No.PA-112)。

2 方法

2.1 敏感肝癌細(xì)胞株的篩選

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將各HCC細(xì)胞株接種在含10%小牛血清，1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長良好呈單層貼壁生長，48～72 h換液1次。傳代時用0.1%胰蛋白酶消化。

2.1.2 索拉非尼藥物配制 用手術(shù)刀片將索拉非尼藥片糖衣輕輕刮去，刮凈糖衣，在稱量紙上將藥片研成粉末狀，稱重后將粉末倒入試管中，加入適量DMSO液，配制成濃度為100 μmol/L的索拉非尼工作液，－20℃保存。

2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 每種細(xì)胞株設(shè)對照組、實驗組;細(xì)胞株用不含EDTA的胰酶消化;將濃度為2×108/L呈指數(shù)生長的細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔2.5 mL(即 5 ×105cells/well)，孵育 24 h;對照組每孔加入0.5 mL DMSO，實驗組每孔加入索拉非尼0.5 mL 溶液(終濃度為 4 μmol/L)，每組設(shè) 3 個復(fù)孔，孵育72 h;收集、離心，PBS液洗滌，重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL propidium iodide(PI)，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

2.1.4 CCK-8法檢測 每種細(xì)胞設(shè)空白組(培養(yǎng)液+CCK-8)、對照組(細(xì)胞+培養(yǎng)液+CCK-8)、實驗組(細(xì)胞+培養(yǎng)液+索拉非尼+CCK-8);取對數(shù)生長期的Huh7、MHCC97、HepG2 、SMCC7721 和HepG2.2.15細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×107/L，96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液;各組設(shè)4個不同索拉非尼作用濃度，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔;5%CO2、37℃孵育，吸凈培養(yǎng)液，加入無血清的DMEM液“饑餓細(xì)胞”24 h;吸凈培養(yǎng)液，對照組加入培養(yǎng)液200 μL，實驗組內(nèi)加入不同量的索拉非尼溶液，余量液體用培養(yǎng)液補足，每孔液體量200 μL，孵育24 h;加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長比色測定每孔吸光度(A)值，記錄結(jié)果;細(xì)胞存活率(%)=(Aa－Ab)/(Ac－Ab)×100%;a:實驗孔;b:空白孔;c:對照孔。

2.2 索拉非尼對敏感肝癌細(xì)胞株MAPK信號通路基因表達(dá)譜的影響

2.2.1 選擇上述實驗所篩選的敏感肝癌細(xì)胞株P(guān)LC細(xì)胞。

2.2.2 細(xì)胞分組 在3.5 cm直徑的培養(yǎng)盤中培養(yǎng)，分2組:PLC對照組(Pc組)和PLC+索拉非尼組(Pt組)。細(xì)胞貼壁后，Pc組加入DMSO液，Pt組加入索拉非尼，用藥濃度為5.25 μmol/L，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)盤中直接中加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，裂解時用槍吸打幾次，然后分別放－80℃保存。置于干冰中運送至上?？党缮锕具M(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2.3 PCR array操作 (1)RNA抽提:劇烈振蕩經(jīng)Trizol裂解后樣本15 s，15～30℃孵育2～3 min。4℃下12 000×g離心15 min，將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，勻漿時加入1 mL Trizol試劑的同時加0.5 mL的異丙醇?；靹蚝?5～30℃孵育10 min，4℃ 12 000×g離心10 min。移去上清液，加入75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃ 7 500×g離心5 min。去除乙醇溶液，干燥RNA沉淀5～10 min，溶解RNA，55～60℃孵育10 min，保存于－70℃。(2)cDNA合成:按試劑盒操作說明，每個純化柱的中心加入50 μL無RNA酶的H2O，放置2 min后8 000×g離心1 min，得到的溶液即純化的cRNA，暫時保存于冰中。(3)實時定量PCR:小心打開PCR array上的膜，加10 μL混合液到PCR array對應(yīng)的每個孔中，小心蓋上蓋子密封PCR array，置于PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用ΔΔCt方法:(1)計算每個處理組中的每個通路相關(guān)基因的ΔCt:ΔCt(group 1)=average Ct－ average of HK genes’Ct for group array;(2)計算2個PCR array(或2組)中每個基因的ΔΔCt:ΔΔCt= ΔCt(實驗組)－ΔCt(對照組);(3)通過2－ΔΔCt計算實驗組與對照組對應(yīng)基因的表達(dá)差異。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞株凋亡

Huh7、MHCC97H、HepG2 、SMCC7721、HepG2.2.15和PLC肝癌細(xì)胞株經(jīng)索拉非尼作用后，細(xì)胞凋亡均較對照組明顯增加(P＜0.05)，見圖1。從凋亡細(xì)胞百分比可以看出，對索拉非尼較敏感細(xì)胞株為PLC細(xì)胞和 HepG2.2.15細(xì)胞(P ＜ 0.01)，對其相對不敏感細(xì)胞株為SMCC7721細(xì)胞和MHCC97H細(xì)胞，見圖2。

2 索拉非尼對各肝癌細(xì)胞株存活率的影響

由各細(xì)胞系的IC50值可看出，對索拉非尼相對敏感細(xì)胞株為PLC細(xì)胞，不敏感細(xì)胞株為SMCC7721細(xì)胞，見圖3。

3 MAPK PCR array實驗結(jié)果

與對照組比較，實驗組MAPK信號通路中有8個差異表達(dá)基因，其中＞2.0倍有2個，≤0.5倍有6個。其中，細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1，CCNE1)、周期素依賴性激酶 6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)和周期素依賴性激酶抑制因子1C(cyclin-dependent kinase inhibitor 1C，CDKN1C)與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān);jun原癌基因(jun proto-oncogene)、CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein，CREBBP)、MAP 激酶相互作用絲/蘇氨酸激酶1(MAP kinase-interacting serine/threonine kinase-1，MKNK1)和MAP激酶激活的蛋白激酶3(MAP kinase-activated protein kinase 3，MAPKAPK3)與轉(zhuǎn)錄因子的活化有關(guān)，見表1。

討 論

本研究以索拉非尼作用不同肝癌細(xì)胞株Huh7、MHCC97H、HepG2、SMCC7721、HepG2.2.15 和 PLC，然后通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，索拉非尼實驗組對上述各種肝癌細(xì)胞的促凋亡作用均明顯強于對照組(P＜0.05)。用不同濃度的索拉非尼作用于這些細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不同其IC50值有差異，通過流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8實驗，篩選出對索拉非尼敏感細(xì)胞株和不敏感細(xì)胞株分別為PLC和SMCC7721。篩選索拉非尼敏感和不敏感肝癌細(xì)胞株對于后續(xù)索拉非尼相關(guān)基礎(chǔ)研究有重要意義，可供同行參考。

研究表明，基因和蛋白質(zhì)較少單獨起作用，它們往往通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)交互作用共同影響生物系統(tǒng)的功能。索拉非尼作用于肝癌涉及的信號通路尚包括STAT3［6］、PI3k/Akt/mTOR 信號通路等［7］。由于索拉非尼主要通過抑制Raf-1抑制MAPK信號通路，MAPK信號通路同時也是索拉非尼設(shè)計的其它作用靶點如VEGFR2、VEGFR3、PDGFR等分子下游的主要信號通路，因此，本研究重點深入研究MAPK信號通路具體分子基因的表達(dá)變化。

Figure 1.Cell apoptosis determined by flow cytometry.PLC，SMMC7221，HepG2.2.15，Huh7，HepG2 and MHCC97H cells were exposed to sorafenib for 72 h，then 5 μL Annexin V-FITC and 5 μL propidium iodide(PI)were added for 10 min of incubation.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

Figure 2.Apoptotic rates determined by flow cytometry.Mean ±SD.n=3.△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞百分比

Figure 3.Survival rates of different hepatocarcinoma cell lines treated with sorafenib(2.5，5，15 and 20 μmol/L)for 24 h were determined by CCK-8 assay.Mean ±SD.n=3.The IC50 values of sorafenib were 5.25 μmol/L for PLC cells，5.30 μmol/L for HepG2.2.15 cells;6.80 μmol/L for Huh7 cells，7.01 μmol/L for HepG2 cells，11.7 μmol/L for MHCC97H cells and 15.0 μmol/L for SMCC7721 cells.圖3 索拉非尼作用后各肝癌細(xì)胞株的存活率

MAPK信號通路PCR芯片包含了與MAPK信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)的全部84種基因。實驗組MAPK信號通路中有8個差異表達(dá)基因，其中＞2.0倍的有2個，≤0.5倍的有6個。其中，CCNE1、CDK6和 CDKN1C與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān);jun、CREBBP、MKNK1和MAPKAPK3與轉(zhuǎn)錄因子的活化有關(guān)。CCNE1基因編碼cyclin E1，CDKN1C編碼p57Kip2。一般而言，cyclin E1和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)2結(jié)合，成為細(xì)胞從G1進(jìn)入S期的關(guān)鍵激酶復(fù)合物，磷酸化相關(guān)底物蛋白而發(fā)揮作用;而p57Kip2作為抑制因子，可結(jié)合cyclin E1-CDK2使其失去活性［8］。已有報道，p57Kip2和HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系，p57Kip2失活與低分化的HCC密切相關(guān)，是HCC預(yù)后的一個獨立預(yù)測因子［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼作用PLC細(xì)胞株后，CDKN1C(p57)上調(diào)，CCNE1(cyclin E1)和CDK6下調(diào)，但索拉非尼影響p57-cyclin E1-CDK6細(xì)胞周期調(diào)控機制的具體過程，值得進(jìn)一步研究。由于索拉非尼在應(yīng)用過程中可發(fā)生耐藥，部分患者在應(yīng)用的后期對索拉非尼失去反應(yīng)，腫瘤因此發(fā)生進(jìn)展，導(dǎo)致治療效果下降。因此，目前有提倡聯(lián)合用藥，提高索拉非尼治療HCC的療效的相關(guān)研究［10］。另有研究表明，miR-195在 85.7% 的HCC中顯著下調(diào)，而CDK6則是miR-195的一個作用靶點［11］。索拉非尼有無可能通過miR-195-CDK6機制抑制HCC細(xì)胞，有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于microRNA、索拉非尼和 HCC三者關(guān)系的研究較少［12-13］，而microRNA是未來藥物研究的一個方向。我們的實驗結(jié)果為未來的索拉非尼研究提供了相關(guān)的線索。

本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼作用后MAPK信號通路中的jun上調(diào)，這與最近Cervello等［14］的研究一致。他們運用全基因組芯片，利用索拉非尼作用HepG2細(xì)胞株，同樣發(fā)現(xiàn)jun基因上調(diào);他們的研究還發(fā)現(xiàn)，索拉非尼作用后，HRK mRNA和c-Jun顯著上調(diào)且HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，而HRK正是c-Jun作用的的一個基因靶點，另外抑制c-Jun信號通路可與索拉非尼發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。本研究所采用的細(xì)胞系和Cervello等［13］的不同，但有相似的結(jié)果，提示本研究的實驗結(jié)果較為可靠，c-Jun上調(diào)可能是索拉非尼抑制HCC細(xì)胞時發(fā)生的共同現(xiàn)象;同時，也提示在索拉非尼抑制肝癌的研究領(lǐng)域中，有必要進(jìn)一步對c-Jun信號通路在其中的具體機制進(jìn)行研究。

表1 Sorafenib處理PLC細(xì)胞后MAPK信號通路的差異表達(dá)基因Table 1.Differential expression of MAPK signal genes in sorafenib-treated PLC cells

總之，本研究篩選出對索拉非尼敏感的HCC細(xì)胞系，并利用此敏感細(xì)胞系，通過MAPK信號通路基因芯片，鑒定出索拉非尼作用后MAPK信號通路中發(fā)生變化的具體分子，這些分子主要與細(xì)胞周期調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子活化相關(guān)，為進(jìn)一步的研究提供了線索和方向。

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