黃郁凱， 李曉紅， 潘 宇， 林秋雄， 朱杰寧， 江雪燕， 葉力通， 余細勇

肌肉營養(yǎng)不良是一種X連鎖隱性遺傳病，其中Duchenne型肌營養(yǎng)不良是最常見與最重要的一種類型，主要發(fā)生在兒童身上，大多數患兒死于20歲前，目前沒有比較好的治療方法。干細胞移植呈現出比較好的前景，其中在骨骼肌里面存在的骨骼肌干細胞，為治療Duchenne型肌營養(yǎng)不良提供了一種新的治療策略［1-2］。骨骼肌干細胞也稱骨骼肌衛(wèi)星細胞，主要存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，具有自我更新、多向分化的能力，在骨骼肌的損傷修復中起著重要的作用，并在心肌等疾病的自身修復中顯示了良好的臨床應用前景［3-4］。但肌肉來源的干細胞在成年大鼠骨骼肌中含量較低，目前的分離培養(yǎng)方法主要是差速貼壁法和組織塊法［5-6］，存在消化時間長、純化效率低、培養(yǎng)過程中細胞易分化等問題，影響了種子細胞的批量獲取，進而阻礙了自體細胞移植的研究。懸浮培養(yǎng)是指細胞在低速貼壁的培養(yǎng)條件下生長，它能模擬組織三維結構，最大限度維持細胞的分化潛能。另外，在懸浮的狀態(tài)下，分化的成體細胞會停止生長而干細胞會繼續(xù)快速生長、逐漸克隆成細胞團，因此對純化干細胞有比較好的效果［7-8］。最近研究表明從小鼠和人的骨骼肌里能分離出骨骼肌干細胞并在懸浮培養(yǎng)的條件下長成細胞團［9］，但相關分離培養(yǎng)方法尚未在成年大鼠中建立，所以本研究的目標是探索成年大鼠骨骼肌干細胞的分離和懸浮培養(yǎng)方法，為成年大鼠骨骼肌干細胞的相關轉化醫(yī)學研究打下基礎。

材料和方法

1 動物

成年SD大鼠，雄性，約250 g，由中山大學實驗動物中心提供。

2 主要試劑

胰蛋白酶購自廣州威佳公司，中性蛋白酶購自Roche，Ⅰ、Ⅳ型膠原酶購自 Gibco，配對盒蛋白 7(paired box protein 7，Pax7)單克隆抗體購自博奧森公司，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Hyclone;表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自 Peprotech，Ultra-Low Attachment 6孔板購自Corning，40 μm濾網購自BD。

表1 各基因實時熒光定量PCR引物Table 1.Quantitative real-time RT-PCR primers

3 主要方法

3.1 骨骼肌干細胞的分離 無菌條件下自約250 g的SD大鼠股四頭肌取3～5 g肌肉，將其移入盛有雙抗PBS的培養(yǎng)皿中，剔除筋膜后剪1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，再轉移到盛有1 g/L中性蛋白酶、1 g/LⅣ型膠原酶、2 g/LⅠ型膠原酶和2 g/L胰蛋白酶混合消化液的50 mL離心管中，37℃水浴箱中消化40 min，每5 min搖1次，最后200目不銹鋼網篩過濾到50 mL離心管中，加入5 mL FBS終止消化，1 200 r/min和離心10 min，棄上清。用含有20 μg/L EGF和20 μg/L bFGF的DMEM/F12重懸，種入Ultra-Low Attachment 6孔板中，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

傳統(tǒng)差速貼壁法:獲得的單細胞混懸液接種到培養(yǎng)瓶內2 h后將培養(yǎng)液及非貼壁的細胞轉移到涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)擴增以去除未消化纖維碎片和易貼壁的成纖維細胞。

3.2 骨骼肌干細胞團的形成 每隔1 d加入500 μL新鮮的培養(yǎng)基，3 d后，將懸浮培養(yǎng)液轉移到50 mL離心管內，讓小細胞團沉淀30 min后，半量換液。當觀察到大細胞團的形成時，用40 μm的濾網過濾，然后接種到6孔板中培養(yǎng)，繼續(xù)觀察。

3.3 總RNA的提取和qRT-PCR 用TRIzol提取骨骼肌干細胞的總RNA，逆轉錄獲得cDNA，熒光定量PCR過程使用SYBR? Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒。各引物序列見表1。

3.4 免疫細胞化學染色 將接種于載玻片上的骨骼肌干細胞用PBS洗3次，每次3 min;多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，每次3 min;加入抗 pax7抗體，常溫孵育60 min，PBS洗3次，每次3min;加入帶熒光標記的Ⅱ抗，常溫孵育60 min后，PBS洗3次，每次3 min;加入DAPI染料，常溫孵育5 min，PBS洗3次，每次3 min;水溶性明膠封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

3.5 細胞的多能性特征鑒定

3.5.1 成脂分化誘導 成脂分化培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12、1 mmol/L地塞米松、10 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、100 mmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰島素、10%FBS和1%雙抗。將配置好的成脂分化培養(yǎng)基加入到貼壁的骨骼肌干細胞中，每3 d換1次液，2周后，oil red O染色觀察。

3.5.2 成骨分化誘導 骨分化培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12、10% FBS、50 mg/L L-抗壞 血 酸、10 mmol/L甘油磷酸、100 nmol/L地塞米松和1%雙抗。將配置好的成骨分化培養(yǎng)基加入到貼壁的骨骼肌干細胞中，每3 d換1次液，2周后，Alizarin red S染色觀察。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 骨骼肌干細胞的分離和細胞團的形成

經酶消化分離出的骨骼肌干細胞呈現圓形或長梭形亮點，懸浮于培養(yǎng)液中。在低吸附6孔板中能逐漸長成細胞團，2～3 d可觀察到細胞團的形成，5～7 d有大細胞團的形成，呈球形、輪廓光滑透亮。把細胞團種入到6孔板中，1 d后大部分細胞團會貼壁，2 d后可見有細胞開始從細胞團中爬出來，猶如太陽狀，當細胞全部爬出來后，太陽狀慢慢消失，與傳統(tǒng)差速貼壁培養(yǎng)方法相比，相同培養(yǎng)時間下的細胞輪廓更光滑透亮，見圖1。

Figure 1.The growth process of skeletal muscle stem cells(×200).A ～D:suspension culture at 1，3，5 and 8 d;E～F:adherent culture at 2 and 5 d;G:the cell culture for 7 d with the traditional method.圖1 骨骼肌干細胞生長過程

2 骨骼肌干細胞的鑒定

2.1 qRT-PCR檢測干細胞標志物和骨骼肌干細胞標志物 和傳統(tǒng)差速貼壁方法相比，新方法所獲細胞的干細胞標志物Nanog、Oct4和骨骼肌干細胞標志物Myf5、Pax7有比較高的表達，這表明該方法得到的細胞純度更高，干性更好，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of Nanog，Oct4，Myf5 and Pax7 in skeletal muscle stem cells.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs traditional method.圖2 骨骼肌干細胞Nanog、Oct4、Myf5和 Pax7 mRNA的表達

2.2 骨骼肌干細胞免疫化學染色 和傳統(tǒng)差速貼壁法相比，Pax7在懸浮培養(yǎng)法獲得的骨骼肌干細胞中的表達更強，這也表明該方法得到的骨骼肌干細胞純度更高，見圖3。

Figure 3.The expression of Pax7 in skeletal muscle stem cells obtained by the new method and the traditional method(immunocytochemical staining，×400).圖3 骨骼肌干細胞的免疫化學染色

3 細胞的多能性特征鑒定

3.1 肌管的形成 骨骼肌干細胞貼壁培養(yǎng)7 d左右融合到60%～70%，開始有散在和方向不一致的骨骼肌衛(wèi)星細胞相互融合，形成短小的肌管細胞，隨著時間的延長，細胞密度增大，細胞之間的融合更為廣泛，肌管細胞的形成明顯增加。倒置相差顯微鏡下可見，見圖4A。

3.2 成脂分化誘導 用成脂分化誘導培養(yǎng)基誘導10 d后，能看到小脂滴的形成，逐漸變大變多，用oil red O染色顯示為紅色，見圖4B。

3.3 成骨細胞分化誘導 成骨誘導培養(yǎng)基誘導14 d后，細胞慢慢長滿，能觀察到一些晶體的形成，用Alizarin red S染色時，顯示為橙紅色，見圖4C。

Figure 4.Multi-lineage differentiation capacity of skeletal muscle stem cells(×200).A:skeletal muscle stem cells differentiated into myotubes;B:verification of lipid accumulation by staining with oil red O;C:Alizarin red S staining of calcium phosphate.圖4 骨骼肌干細胞的多能性鑒定

討 論

骨骼肌干細胞存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，當骨骼肌組織受到損傷時這些靜息期的干細胞就會被激活并分裂增殖分化相互融合完成創(chuàng)面修復。目前骨骼肌干細胞因具有以下幾個優(yōu)點而被臨床認為是一種理想細胞:(1)自體來源取材方便，易于在體外擴增;(2)骨骼肌是藥物注射的常用組織，具有一定的耐受性;(3)能高水平表達有活性的重組蛋白并具有分泌性;(4)移植后可與宿主的肌肉細胞融合形成多核肌細胞，延長細胞存活期;(5)肌肉組織高度血管化，使分泌出的重組蛋白直接進入血液循環(huán);(6)移植后不干擾鄰近組織的正常生理功能，臨床應用時更加簡便安全。

考慮到成年骨骼肌干細胞的治療潛能，探索其高效分離、純化和擴增方法是非常必要的。傳統(tǒng)的分離方法常用膠原酶、胰蛋白酶消化或者組織塊法獲得骨骼肌干細胞［11-13］，但由于衛(wèi)星細胞是一種位于肌纖維的肌膜與基底膜之間的組織干細胞，細胞連接緊密，能抵抗一般消化酶的作用。本研究采用混合酶可以發(fā)揮疊加作用，使肌肉組織充分分解、消化，有利于簡便、快捷地分離出骨骼肌干細胞。在骨骼肌干細胞純化方面，傳統(tǒng)的純化手段包括差速貼壁和Percoll液梯度離心法［10-12］，但存在程序復雜、細胞損失大、純度不夠高等缺點。最近有報道從人骨骼肌里通過懸浮培養(yǎng)的方法分出了骨骼肌干細胞團，并發(fā)現通過懸浮培養(yǎng)能很好地維持骨骼肌干細胞的干性，并能達到批量擴增的目的［9］。目前能否用懸浮培養(yǎng)的方法從成年大鼠骨骼肌中培養(yǎng)出細胞團尚未有報道，所以本實驗旨在建立懸浮培養(yǎng)法獲得成年大鼠骨骼肌干細胞團的方法。越來越多的研究表明，細胞生長環(huán)境對細胞增殖、分化、干性維持有很大的影響［13］。在細胞成團培養(yǎng)中懸浮培養(yǎng)起到了非常大的作用，因為懸浮培養(yǎng)法還能模擬體內的三維環(huán)境，對維持干細胞的干性和分化潛能有很大的作用，它在脂肪干細胞的培養(yǎng)中也得到了證實［7］。

本研究觀察到，很多單個細胞能慢慢擴增成一個細胞團，表現出較好的自我更新能力。從這些細胞團獲得的細胞能高表達骨骼肌干細胞標志物Pax7和Myf5，其中Myf5在調節(jié)骨骼肌分化過程中最早出現，缺乏Myf5蛋白的骨骼肌細胞會丟失原有的肌肉形態(tài)［14］。另外，骨骼肌干細胞還表達了干性因子Nanog和Oct4，這些因子能維持胚胎干細胞的多功能性和自我更新能力，說明該方法獲得的細胞是干性較好、還處于分化上游階段的干細胞［15-17］。

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